キネシンパワード分子シャトルバスへのロード貨物

本手順の全体的な目的は、キネシンモーターでコーティングされた表面上で滑走する微小管にナノ粒子をロードすることです。まず、ガラス製フローセルの表面をカゼイン溶液でコーティングします。次に、フローセル表面にキネシンモータータンパク質を吸着させます。

手順の3番目のステップは、微小管を添加することです。手順の最終ステップは、微小管に結合するストレプトアビジン分子を添加し、次にナノスフェアを添加することです。ナノスフェアはフローセル表面に結合し、そこで微小管によって回収されます。

最終的に、蛍光顕微鏡を用いて、ナノ粒子が微小管に取り込まれ、表面を横切って輸送される様子を観察することができます。こんにちは。私はフロリダ大学材料科学工学科のHenry Hess博士の研究室から来ました、Elaine Jen Smithです。本日は、反転運動性アッセイの手順をご紹介します。

当研究室では、微小管へのカーゴのローディングおよび分子シャトルの移動を研究するために、この手順を用いています。それでは始めましょう。この手順を開始する前に、本ビデオの解説資料に記載されている通り、すべてのストック溶液を新しく調製してください。

ストック溶液を調製した後、0.65 mL マイクロ遠心チューブに成長溶液を 25 µL ピペッティングして、微小管の調製を開始します。次に、20 µg の凍結乾燥ビオチン化チューブリンに成長溶液を 6.25 µL 加えます。溶液をボルテックスし、37 °C の恒温槽に 30 分間置いて重合させます。インキュベーション後、溶液を Taxol Buffer で 100 倍に希釈し、穏やかにボルテックスします。

この溶液は微小管を安定化させるためのものです。溶液に「MT 100」とラベルを貼り、室温で保存してください。次に、MT 100をアンチフェードバッファーで10倍に希釈し、この溶液に「MT 1000」とラベルを貼ります。

次に、キネシン溶液をTPバッファーで20倍に希釈して、キネシンモーターを調製します。この溶液に「kinase in 20」とラベルを貼り、氷上で保存します。最後に、ストレプトアビジン溶液とナノスフィア溶液を作製します。

まず、Antifa Bufferを用いて、Alexa Fluor 5 6 8標識ストレプトアビジンの濃度を100 nano molarsに調製します。この溶液にSTV 100とラベルを付けます。次に、ナノスフィアをAntifa Bufferで5,000倍に希釈し、この混合液にNS 5,000とラベルを付けます。これら両方の溶液を氷上で保存します。

カーゴローディングアッセイ用の溶液調製後、カバースライドとガラスカバーガラスを両面テープで分離させてフローセルを作製します。まず、カバースライドの両端に2本の両面テープを貼り付け、テープの間に約1 cmの隙間を設けます。次に、そのテープの上にカバーガラスを載せます。

ピンセットの平らな端を使用してカバーガラスに圧力をかけ、密閉します。作製されたフローセルは、長さ約2 cm、幅約1 cm、高さ100 µmで、体積は約20 µLになります。これで倒置アッセイの組み立てを開始します。

ピペットのチップをカバーガラスとスライドガラスの間に配置します。次に、0.5 mg/mL のカゼイン溶液をフローセル内に注入します。フローセルをこのようにコーティングすることで、キネシンが吸着した際にもその機能を維持できるようになります。

カゼイン溶液によるコーティングが完了するまで5分間待ちます。次に、ピペットのチップをカバーガラスとスライドガラスの間に差し込み、20のキネシン溶液をフローセルに導入してキネシンを吸着させます。その後、溶液をフローセルの片側から注入し、同時に反対側から吸い出します。

フィルターペーパーを用い、キナーゼinを吸収させるために5分間待ちます。次に、MT 1000溶液をフローセルにピペッティングし、微小管をフローセルに導入します。微小管がキナーゼinモーターに付着した後、微小管が沈降し、キナーゼinモーターに結合するまで5分間待ちます。

フローセルにSTV 100溶液を導入し、微小管を蛍光標識strep TTRでコートします。strep TTR分子が微小管に結合するまで5分間待ちます。フローセルにAntifa溶液を30 µLずつ3回導入して洗浄し、過剰なstrep TTRを除去します。

最後に、NS 5,000溶液をフローセルにピペッティングし、ビオチン化ポリスチレンフルオレセインナノスフェアを導入します。表面は固定化されます。ナノスフェアは移動する微小管に衝突し、それに結合します。

本実験では、100倍油浸対物レンズ、X site、120Wランプ、およびExon EMCCDカメラを搭載したEclipse TE2000U蛍光顕微鏡を使用します。まず、対物レンズの上にイマージョンオイルを1滴滴下します。次に、Trixyフィルターキューブを用いて、フローセルを顕微鏡ステージ上に設置します。

微小管にピントを合わせ、次いでfitzyフィルターキューブに切り替えてナノ粒子を観察します。次に、andまたはI exonプログラムを開き、取得モードをkineticに設定します。露光時間を0.5秒、kineticシリーズ長を20、kineticサイクル時間を6秒に設定して使用します。

顕微鏡の切り替えスイッチを接眼レンズからカメラに切り替え、画像の取得を開始します。最初の4枚の画像については、trixiキューブを使用して微小管を撮影します。続く12枚の画像については、Fitzフィルターキューブに切り替えてナノ球の画像を撮影します。

その後、trixiフィルターキューブに切り替えます。微小管を撮像するための最後の4枚の画像では、Trissyフィルターキューブを用いて微小管を観察し、フィルターキューブをfiteに切り替えます。ここでナノスフィアを可視化すると、微小管によって輸送されているナノスフィアが矢印で示されています。すべてのナノスフィアが微小管に捕捉されたわけではありません。

36秒後のナノ球の位置を示すと、ナノ球が移動していることがわかります。再び微小管を撮像すると、微小管もまた視野を横切って移動していることが明らかになります。これらの画像は、微小管のシャトリングによってナノ球が変位したことを示しています。

以上で、逆方向運動能アッセイの実施方法について説明しました。この手順を行う際は、画像取得中にフィルターキューブを切り替えて、微小管とナノスフィアの両方が観察できるようにすることが重要です。これで完了です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。