ソフト筋骨格組織から幹細胞を単離する

この手順の全体的な目的は、骨格筋などの筋骨格系軟組織から成人幹細胞を単離することです。まず、軟組織の生検を行い、デブリードマンを施して細かく刻むことでこれを達成します。次に、組織を酵素的に消化します。

手順の第3ステップは、プリプレーティング工程を繰り返すことで幹細胞を単離することです。手順の最終ステップは、単離した幹細胞の同定です。最終的に、免疫蛍光染色、顕微鏡観察、および/またはフローサイトメトリーを用いて、細胞の形態学的および細胞学的挙動を示す結果を得ることができます。

こんにちは。ピッツバーグ大学整形外科、分子病理学研究室のy Leeです。本日は、骨格筋などの musculoskeletal system の軟組織から成体幹細胞を単離する方法を解説します。こんにちは、Johnny Ward博士です。

私はピッツバーグ大学医学部整形外科の教授です。これまでYoung Lee博士と密接に協力し、骨格筋や、標準的な組織などの異なる種類の幹細胞を単離する手順に取り組んできました。私たちの研究室では、主にトランスレーショナルリサーチへの応用を目的とした研究のために、これらの手順を用いて幹細胞を単離しています。

それでは、研究に取り組みましょう。幹細胞を単離可能な組織として、野生型マウスの後肢の脛骨またはヒラメ筋から採取した腱および骨格筋を用います。皮膚と骨の残渣を取り除いた後、組織を5% FBSを添加した冷たいHBSSを含むディッシュに入れます。

次に、組織を冷えたHBSSを含むコラーゲンコートディッシュにそれぞれ配置します。ここでは、組織の解離および消化の基本手順を説明するために、骨格筋組織を使用します。マイクロシザースまたはメスを用いて、骨格筋組織を粗いスラリー状に刻み、組織の酵素消化を行います。

まず、MIT組織スラリーを個別の15 mLチューブに移し、4°C、約3,500 RPMで5分間遠心分離します。HBSSで再懸濁してSANE洗浄液を除去し、遠心分離を繰り返します。上清を除去した後、あらかじめ温めておいた0.2% collagenaseを10 mL加えてスラリーを消化します。

タイプ11を37°Cで60分間インキュベートし、その間10分ごとにチューブを手で振盪します。60分間のインキュベーション終了後、遠心分離を行い、スラリーを10 mLのDYS space solutionに再懸濁します。37°Cで45分間インキュベートし、その間10分ごとに手で振盪します。45分間のインキュベーション後、遠心分離を行い、スラリーを10 mLの0.2% trips in HBSS solutionに再懸濁します。

通常、チューブを10分ごとに転倒混和しながら、37 °Cで15〜20分間インキュベートし、インキュベーションを完了させます。ここに示すように、組織から十分な数の単一細胞が放出されたら、得られた細胞を遠心分離し、細胞ペレットを5 mLの増殖培地（PM）で再懸濁します。抽出液を、18ゲージの針で2回、次に23ゲージの針で1回、最後に27ゲージの針で1回と、一連の針に通すことで細胞懸濁液を分散させます。

最後に、70 µmのセルストレーナーに細胞抽出液を通し、prepl法を開始します。調製した細胞抽出液を遠心分離し、ペレットを増殖培地に再懸濁します。細胞混合液5 mLをコラーゲンコートしたT 25フラスコに分注してPP1と表記し、37 °C、5% CO2の加湿インキュベーター内で2時間培養します。

2時間後、非接着細胞を新しいコラーゲンコートT 25フラスコに移し、PP2として標記します。元のPP1と標記したT 25フラスコに、PMを5 mL加えます。

両方のフラスコをインキュベーターに戻し、24時間培養します。24時間後、PP twoから非付着細胞を新しいコラーゲンENCコーティングT 25フラスコに回収し、これをPP threeとして標記します。PP twoと標記されたフラスコに、増殖培地を5 mL加えます。

フラスコをインキュベーターに戻します。この手順を24時間ごとに繰り返し、PP6まで継続します。これにより、幹細胞集団が作成されます。

単離されたPP6細胞は数が非常に少なく、FBSを豊富に含む増殖培地で維持する必要があります。培地は毎日交換してください。ただし、PP6培養の細胞の大部分は、その後1〜2週間の培養期間中に死滅します。

通常、さらに1〜2週間の拡大培養を行うことで、十分な数の健康なPP six集団が形成されます。他のすべての浮遊細胞群についても同様に維持し、増殖させながら倒立顕微鏡で定期的に観察してください。PP oneおよびPP twoフラスコに早期に接着する細胞は、その大部分が線維芽細胞です。

48時間から96時間という長い時間をかけてコラーゲンコートしたフラスコに接着した細胞。PP3およびPP4は主に筋芽細胞である。筋衛星細胞は多くの場合PP5に主に認められるが、96時間以降のより後期のprepl細胞（PP6）は成人幹細胞と見なされ、小さく丸い半透明の形態を示す。

分離の初期段階において、stem cell antigen oneやCDC 34などの幹細胞マーカーの発現を確認するため、免疫組織化学染色によりさらなる特性解析を行うことができます。以上で、マウスの骨髄から幹細胞を分離する方法を説明しました。この手順を行う際は、すべての工程において無菌状態を維持することが重要です。

幹細胞を単離した後、細胞の幹細胞としての特性を維持するために、低密度で培養するようにしてください。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。この手法をぜひ皆様の実験でお役立てください。

ありがとうございました。