移行のヒトTリンパ球の単離、培養および解析インビトロ

Tリンパ球の遊走は、リンパ器官へのホーミング、血管系からの脱出、および末梢組織への進入の際に起こります。このプロセスには、T細胞表面と他の細胞との接着相互作用が関与しています。この現象をin vitroで検討するために、ヒトTリンパ球を単離・培養し、接着タンパク質でコーティングした組織培養プレート上に配置します。

ICAM-1およびケモカインSDF-1です。これにより、Tリンパ球の遊走画像を収集し、解析することが可能になります。こんにちは、ロチェスター大学ワクチン生物学・免疫学センターのMinsu Kim研究室のCraig LeFortです。

本日は、ヒトTリンパ球の単離および培養と、そのin vitroにおける遊走能の解析手順について解説します。当研究室では、インテグリンの役割とT細胞の遊走を研究するためにこのアッセイを用いています。T細胞における主要なインテグリンは、リンパ球機能関連抗原1（LFA-1）です。

LFA-1の特異的リガンドはICAM-1などのICAM分子です。さらに、T細胞の遊走には、方向性のシグナルを提供し、かつインテグリンを活性化させるためのケモカインシグナルが必要です。本アッセイでは、T細胞遊走の基質として、ヒトICAM-1およびCXCL12（SDF-1）を使用します。

それでは始めましょう。健康なドナーからヒト血を得た後、血液を室温まで冷却させます。これには約 30 分かかります。

血液を冷却した後、室温のポリモルフ密度勾配培地 3 mL を 8 mL の丸底ポリスチレンチューブに静かにピペットで分注します。次に、その上に全血 3 mL を静かに加えます。この際、混ざらないようにすることが重要です。

チューブを遠心分離機にセットし、500 Gで45分間遠心分離します。遠心分離後、室温において末梢血単核細胞（PBMC）が他の血液成分から分離されます。PBMC層は、上から1番目の白濁したバンドとして現れます。

無菌条件下で、上の透明な黄色い層を慎重に取り除いて廃棄します。次に、P 1000 マイクロピペットを使用して、PBMC層を新しいコニカルチューブに移します。PBSでPBMCを2回洗浄し、細胞を 500 G で5分間遠心分離します。

洗浄後、上清は毎回わずかに濁ります。10% FBS、1% ペニシリン・ストレプトマイシン、および 1 µg/mL のフィトヘマグルチニン（PHA）を含む 20 mL の RPMI 1640 培地で細胞を再懸濁します。PHA 存在下でのインキュベーションにより、T リンパ球の活性化と増殖が誘導されます。

ピペットを用いてPBMCをT 75培養フラスコに転送します。次に、37 °C、5% CO2条件下で1〜24時間インキュベートします。この工程により、フラスコ表面に接着する単球を、浮遊状態のままとなるリンパ球から分離させることができます。

インキュベーション後、主にリンパ球を含む培地をすべて慎重に取り除き、15 mLコニカルチューブに移します。500 Gで5分間遠心分離します。細胞ペレットをRPMI 1640で再懸濁し、FBS、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびPHAを含む25 mLのRPMI 1640が入った新しいT 75フラスコに細胞を移し、37 °Cでインキュベートします。

24時間の培養後、15～20 mLの新鮮な培地を添加し、より大きなT 175フラスコに継代させる必要がある場合があります。そのまま2～3日間 incubation を継続してください。PBMCの初回 incubation を一晩行い、その後3日間経過した場合は、ピペットを用いて浮遊リンパ球を含む培地を除去し、50 mLコニカルチューブに移して 500 G で5分間遠心分離します。

Reeseは細胞ペレットを回収し、25 millilitersのRPMI 1640にFBS、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびヒトIL-2またはIL-15を添加した新しいT 75フラスコに細胞を移しました。その後、細胞をインキュベーターに入れます。T 75フラスコから開始する場合、培養細胞を拡大し、T 175フラスコに移す必要があります。

1〜2日後、リンパ球を合計4〜7日間培養します。遊走アッセイの1日前に、0.17 millimeterのガラスボトムディッシュを20 micrograms per milliliterのプロテインAまたはGを含むPBSでコーティングし、4 degrees Celsiusで一晩インキュベートします。翌日、ディッシュをPBSで十分に洗浄し、ICAM one FCおよびヒトSD F1を含むPBS溶液をディッシュに加えます。

分子を固定するため、室温で4時間インキュベートします。ヘモサイトメーターを用いて、培養細胞の密度を測定します。その後、リンパ球をPBSで2回洗浄し、D glucoseを含むL 15培地1 mLに再懸濁させます。インキュベーション後、ICAM-1 FCおよびSDF-1でコーティングしたディッシュをPBSで十分に洗浄し、1 mLの培地に懸濁したTリンパ球をディッシュに移します。遊走解析に適した細胞密度を得るため、1ディッシュあたり約2～5 × 10⁵個の細胞を使用してください。

細胞遊走の画像を取得するには、37 °Cの加熱チャンバーなどの温度管理された環境下で、ディッシュを顕微鏡ステージに設置します。画像設定メニューでNIS-elementsソフトウェアを開きます。ライブイメージングと画像キャプチャの両方のモードとして、2×2ビニングを選択します。

アプリケーションメニューに移動し、「define」、「run」、「experiment」を選択します。画像撮影の間隔と合計時間を設定してください。画像キャプチャシーケンスについては、「run」ボタンを押して、設定に従い画像取得を開始します。

速度、移動距離、変位などの遊走パラメータは、Image J Auto Quantやvelocなどのソフトウェアパッケージを用いて定量化できます。スパイダーウェブプロットを作成するには、各細胞および各タイムポイントのXY座標を収集し、各細胞の共通の開始点を原点とするグラフ上に投影します。ここに示したTリンパ球は、ICAMおよびSDF-1をコーティングしたプレート上で培養され、30分間にわたって10秒ごとに撮影されました。

この動画では、各細胞のXYT座標を用いて、Tリンパ球が分速約15 micronsの速度でランダムに遊走する様子を示しています。15個の細胞を無作為に選び、原点を共通の開始点としてプロットしました。スパイダーウェブプロットを比較することで、異なる実験条件間での遊走パターンの違いを視覚的に迅速に把握することができます。

左側にはコントロール条件下でのTリンパ球遊走のプロットを、右側には抗LFA-1リガンド遮断抗体存在下でのTリンパ球遊走のプロットを示します。これらのデータは、Tリンパ球がICAM-1基質上を遊走するためにインテグリンLFA-1を利用していることを証明しています。以上で、培養ヒトTリンパ球を用いた遊走アッセイの手順について解説しました。

細胞の追跡と遊走の解析を簡便にするため、ICAM-1をコートしたディッシュに適切な数の細胞を添加することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。