網膜色素上皮生理学と病態の研究のための実験的モデル

この手順の全体的な目的は、モデルとして使用可能なヒト胎児網膜色素上皮（RPE）の培養物を生成することです。ヒトの眼疾患の研究では、ドナーから眼球全体として組織が提供されます。本手順の最初のステップは、余分な筋肉と結合組織を取り除き、角膜と水晶体を摘出して眼球を開くことです。

眼球をdispaで処理して平坦化し、次いで脈絡膜からRPE単層を剥離します。解剖したRPEをフラスコに播種し、単層がコンフルエントになり色素が形成されるまで数週間培養します。これらの細胞培養物は、in vitro機能実験に使用されます。

in vitro実験で成功した内容は、より複雑なシグナル伝達環境においてRPEの応答をより適切に評価できる前臨床試験動物モデルで再現されます。本手法で示すモデルは、RPEの生理学的機能のさらなる理解と、眼疾患治療のための新たな治療介入につながるものです。こんにちは、シェルドン・ミラーです。

私の研究室は、メリーランド州ベセスダの国立衛生研究所（NIH）キャンパス内にある国立眼科研究所（NEI）にあります。こんにちは、Miller LabのArkiです。本日は、ヒト胎児網膜色素上皮細胞の初代培養を調製する手順をご紹介します。

これらの細胞は、改良シンチャンバーに搭載可能なコンフルエント単層として調製されます。また、これらの単離したヒトRPE細胞を、生化学および遺伝学の研究にも使用します。当研究室ではこの手順を用いて上皮細胞の一次培養を確立し、生理学的および病理生理学的プロセスの機能と調節に関する研究や、疾患の臨床動物モデルの開発を行っています。

ここでは、眼球の背面に位置し、神経網膜と脈絡膜の血流を隔てている網膜色素上皮（RPE）に焦点を当てます。この眼球の模式図は、光受容体に隣接した眼球背面におけるRPE層の位置を示しています。挿入図は網膜の細胞を示しており、右側に光受容細胞、左側に神経節細胞が配置されています。

この上皮は代謝的に極めて活性が高い組織です。日次的に光受容体を絶えず貪食し、視覚色素であるビタミンAを貯蔵、変換、および光受容体へ輸送します。視覚サイクルにおいて、この上皮は周囲の細胞外空間の化学組成と容積を維持するために恒常的に作用します。

上皮細胞の極性は極めて重要な特性です。頂端膜および基底側膜へのタンパク質の継続的な非対称輸送は制御されたプロセスであり、これにより上皮は、ある細胞外空間から別の細胞外空間へと代謝物、イオン、および液体をベクトル的に輸送することが可能になります。この活動は、上皮が神経網膜の健康と完全性を維持するのに役立っています。

本稿で述べるin vitro調製法を用いることで、解剖を開始する前に、上皮の極性と機能を決定する輸送タンパク質、受容体、およびシグナル伝達経路の解析が可能になります。ラミナーフローフード内で、室温の溶液を用いて12ウェルプレートを準備します。眼球1つにつき、10倍濃度の抗生物質・抗真菌剤溶液を1ウェル、1倍濃度のXPBSを2ウェル、および5% RPE血清含有培地で希釈した2 units/mLのdisc spaceを1ウェル用意します。シリコンパッド付きの解剖皿に1倍濃度のH-B-S-Sを満たし、液体を排出した後、各眼球を抗生物質・抗真菌剤溶液のウェルにそれぞれ移します。

室温で3〜5分間インキュベートします。眼球に過剰な圧力をかけないように注意してください。余分な抗生物質を除去するため、XPBSが入った2つのウェルで順次眼を洗浄します。

次に、解剖用ステレオ顕微鏡下で、ピンセットを用いてそれを1X-H-B-S-Sを満たした解剖皿に移します。アイリス剪刀を用いて、眼球周囲の余分な筋肉および結合組織を除去します。角膜が上を向くように眼球を配置します。

2本の滅菌済み27ゲージ針を用い、強膜を損傷しないように結合組織で眼球をシリコンパッドに固定します。この状態で、サイドポートナイフを使用して強膜に切開を加えます。切開部位は、眼球赤道から前方表面までの距離の3分の1の位置としてください。

虹彩剪刀を使用して、網膜色素上皮（RPEと略記）が硝子体網膜の牽引によって損傷するのを避けるため、眼球の周囲を円状に切り進めます。同じ剪刀を用いて硝子体を切断し、前眼フラップを眼杯から分離します。

IOAの前方を持ち上げて取り除きます。ピンセットを使用して、開眼した眼球をdysのウェルに移動させます。眼球内に気泡が入っていないことを確認してください。

37 °C、5% CO2条件下で40分から60分間インキュベートします。眼球をディスクスペースから、新鮮な室温の1X HBSSを満たした解剖皿に戻します。眼球のカップ側を上に向け、2本の27ゲージ針で固定します。

解剖顕微鏡下で、精密ピンセットを用いて、部分的に剥離させた網膜を網膜用ハサミでそっと持ち上げます。視神経から網膜を切り離します。切り出した網膜を虹彩用ハサミで除去します。

眼球の周辺部から視神経に向かって切開します。27ゲージの針5本を用いて、眼球をピンで固定し広げます。RPE層を伸展させるため、網膜用ハサミを使用して視神経の周囲を円状に切開します。

倍率を250倍以上に切り替えて、RPE層を分離します。虹彩剪刀で切開した部位に沿ったRPEシートの端を、視神経の近くで探します。2本のピンセットを使用して、RPEおよびブルッフ膜を脈絡膜組織層から分離します。

切断端に沿った数箇所を試し、RPEと脈絡膜の結合が最も弱い箇所を探します。膜をゆっくりと剥がして、完全に除去します。RPEシートを、室温のtrypsin-EDTAを満たした15 milliliterコニカルチューブに入れます。

すべてのシートを回収したら、チューブにキャップをし、37 °Cのウォーターバスで10分間インキュベートします。チューブを激しく振って、RPEを小さなクラスターに分離させます。色の濃い細胞の塊が見られなくなれば、分離は完了です。

チューブをウォーターバスに戻し、さらに5分間静置します。ペステール、ピペット、および緩やかな吸引を用いて、未消化の組織残渣を除去します。遠心分離機を用いて、280 5Gで4分間、細胞を遠心沈降させます。

上清を除去します。15% RPE培地を用いて最終容量を9 mLに調整し、再懸濁します。細胞懸濁液 3 mLを25 cm²フラスコに分注します。

室温の新鮮な15% RPE培地を2 mL加えます。細胞を37 °C、5% CO2条件下で一晩培養します。培養が進むにつれ、3〜4週間後に色素沈着が増加します。

培養に成功すると、細胞はコンフルエントになり、均一かつ濃い色素沈着が見られます。以上が、ヒト胎児網膜色素上皮（RP）一次培養の調製方法です。

ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。