ランダムDNAライブラリーを使用するプライマーフリーアプタマーの選択

本手順の総合的な目的は、ランダムライブラリから、標的タンパク質（本ケースではS 100 Bタンパク質）に特異的に結合するaberを同定することです。これはまず、制限エンドヌクレアーゼでライブラリを消化し、隣接する固定プライマー配列からランダム配列を遊離させることで達成されます。手順の第2ステップでは、ランダムライブラリ配列を精製したS 100 Bタンパク質に結合させ、それらを回収します。

手順の第3ステップは、ハイブリダイゼーションとライゲーションによって、結合した配列を固定プライマー配列と再結合させることです。手順の最終ステップでは、ライゲーション産物を転写し、結合した候補aberプールのR-T-P-C-Rによる再増幅を可能にし、その後、この選択手順をさらに数ラウンド繰り返します。最終的に、選択されたaberがS 100 Bタンパク質に特異的に結合することを示す結果を得ることができます。

例えばここでは、マイクロアレイを用いたサンドイッチ結合アッセイが行われており、また、機能化ナノワイヤと15 nanometerの金ナノ粒子に結合させた蛍光標識二次抗体を用いたアッセイも行われています。本日は、D配列のランダムライブラリからS hundred Bタンパク質に結合する最適なものを選択する手順について解説します。私たちは、癌の早期検出のためのセンサープラットフォームの開発を含め、さまざまな目的でこの手順を研究室で活用しています。

それでは開始しましょう。この手順を始めるには、既報の方法に従ってプライマーフリー（PF）DNAライブラリを調製します。二本鎖DNAライブラリを切断し、10%変性ポリアクリルアミドゲルを用いてゲル精製を行うことで、5'末端にリン酸を持つ32ヌクレオチド断片（32+断片）および30ヌクレオチド断片（30+断片）が得られます。

32プラスフラグメントは、3'末端にCC最小隣接配列を持つ30ヌクレオチドのランダムドメインを含んでおり、一方、30プラスフラグメントは30ヌクレオチドのランダムドメイン配列のみで構成されています。aptr選択用のPFライブラリーDNAフラグメントを調製するには、32プラスおよび30プラスの各フラグメントを40 µLの20 mM Tris-HCl (pH 7.4) に再懸濁します。その後、サンプルを85 °Cで3分間加熱し、インキュベーションを行います。

サンプルを37°Cのウォーターバスインキュベーターで3分間冷却します。次に、760 µLのセレクションバッファーを加え、37°Cで3分間インキュベートします。3分後、サンプルを室温で10分間保持します。インキュベーション後、溶液を、セレクションバッファーであらかじめ洗浄したニッケルNTAアガロースビーズを含むカラムに通します。

非特異的なDNAを除去するため、カラムに結合しなかったPFライブラリDNA断片を回収し、後で使用するために保管しておきます。S 100 B結合ビーズを調製するには、まず400 µLのニッケルNDAビーズをマイクロ遠心機で3秒間遠心分離し、上清を捨てます。次に、結合バッファー400 µLを用いて、ピペッティングで5回緩やかに洗浄します。

次に、ビーズを遠心分離し、上清を捨てます。この操作を繰り返し、2回洗浄してください。

次に、あらかじめ精製したヒスチジンタグ付きタンパク質をビーズの上に流します。ここでは、ヒトS 100カルシウム結合タンパク質Bを使用します。3分ごとに溶液をゆっくりと5回ピペッティングし、合計15分間行います。

15分後、ビーズを遠心分離し、上清を捨てます。最後に、セレクションバッファー 400 µL を加え、ピペッティングで3回優しく混ぜることで、ビーズに結合した S 100 B を洗浄します。再度、ビーズを遠心分離し、上清を捨てます。

S 100 B結合abersを選択するため、この工程を2回繰り返し、計3回の最終洗浄を行います。 previouslyに取り分けておいた32 plusおよび30 plusフラグメントを回収します。これらのフラグメントをビーズ結合S 100 Bに添加します。その後、サンプルを15分間インキュベートします。

15分後、3分ごとにピペッティングで穏やかに混ぜ合わせ、ビーズを短時間遠心して上清を除去します。次に、800 µLのセレクションバッファーを用いて、ピペッティングで穏やかにS 100 BDNA複合体を洗浄します。その後、ビーズを遠心し、上清を除去します。この洗浄工程を2回繰り返します。

S 100を回収するために、20 millimolar tris, HCL pH 7.4を200 microliters、ビーズに加えます。その後、スラリーを85 degrees Celsiusで3分間加熱します。インキュベーション後、

ビーズを1分間ボルテックスし、遠心分離して沈殿させます。その後、上清を新しいチューブに移します。この手順をもう一度繰り返し、得られた上清を合わせます。

最後に、選択したDNA断片を精製します。PCR産物を、同量のフェノール・クロロホルムおよびイソプロピルアルコールで2回抽出します。250 mMの塩化ナトリウムおよび2.5倍量の100%エタノールを用いて、-70 °Cで15分間沈殿させます。

4 °Cで21,000 GSにて15分間遠心分離します。その後、上清を捨てます。ペレットを75% ethanolで十分に洗浄します。

4°Cで21,000 GSにて5分間遠心分離し、上清を捨てる。10回選択を行った後、ペレットをスピードバキュームで3分間乾燥させる。得られたPCR増幅DNA断片を、Vitrogen Coreから入手したPCR 2.1 topoベクターにクローニングする。

次に、選択した N 30 cc および N 30 フラグメントについて、それぞれ 40 から 50 個のシングルコロニーを M 13 フォワードプライマーを用いてシーケンシングします。infomax vector NTI ソフトウェアを使用して、選択した配列をアラインメントします。その後、アラインメントに基づいてコンセンサス配列を決定します。

コンセンサス配列が特定されたら、書面によるプロトコルに従ってコンセンサスアプタマーを購入します。5'末端にAmin C6基を持つ、合成された最初のアプタマーをプリンティングバッファーに懸濁し、最終濃度を15 micromolarにします。その後、Apogen Discoveries社のマイクログリッドアレイを用いて、アプタマー溶液をCodeLink活性化スライド上にスポットします。

コードリンクで推奨されているプロトコルに従ってください。1枚のスライドに12個のアレイを配置して印刷してください。2×8のフォーマットを使用してください。

ハイブリダイゼーション用のマイクロアレイ・ハイブリダイゼーションカセット。S 100 Bタンパク質を70 µLのPBSで適切な濃度に希釈します。その後、その溶液をマイクロアレイカセットのウェルに適用します。

蒸発を防ぐため、ヌクレアーゼフリーの粘着シール箔を用いてマイクロアレイカセットを密封します。コードリンク上にプリントされたabersにタンパク質を結合させます。室温で1時間インキュベーションした後、個別にスライドさせます。

カセットのウェルを、5 mM 塩化マグネシウム含有PBSまたはPBSMで3回洗浄します。次に、蛍光標識した二次抗体をPBSM 70 µLを用いて0.125 µMに希釈します。この混合液を85 °Cで3分間加熱します。

その後、ラベル化したABERSを氷上で冷却します。ABERSをマイクロアレイカセットのウェルに3分間適用します。再びカセットを粘着フォイルで密閉し、室温で1時間インキュベートします。

再度、個別に処理します。洗浄後、ウェルをPBSMで3回洗浄してください。カセットを分解し、スライド全体をPBSMですすぎます。

次に、遠心分離によってスライドを十分に乾燥させます。最後に、Packard Biosciences社のスキャンアレイを用いてスライドをスキャンします。$\gamma$ P$^{32}$ ATPで5'末端標識したアプタマーのS100Bタンパク質に対する4,000 XL結合量を測定し、K$_{D}$決定のために濃度に対してプロットしました。

約7 roundsの選別後の代表的なKd値は、通常10⁻⁷ Mの範囲になります。5'末端にアミノ基を導入した第1アプタマーをCodeLinkマイクロアレイに結合させました。精製したS100Bタンパク質を第1アプタマーに結合させ、続いてLOR 546で標識した第2アプタマーをS100B-第1アプタマー複合体に結合させました。

走査アレイスキャナーを用いて蛍光を定量しました。中段の行はサンドイッチ結合を示しており、上下の行のKDアッセイにおける相加的な結合によって特徴付けられます。abersの5'末端チオール誘導体についてはサンドイッチ結合は見られず、標準的なチオール化学を用いて金ナノワイヤに結合させました。

同様の方法で、2番目の抗体を50 nMのまたは金ナノ粒子（gold nps）に結合させた。その後、精製したS 100 Bタンパク質をまず誘導体化ナノワイヤ上の第1アプタマーに結合させ、続いて50 nMの金ナノ粒子結合第2アプタマーを、第1アプタマー・ナノワイヤ・S 100 B複合体に結合させた。結合したサンドイッチ複合体は、FE-SEMを用いて可視化した。

S 100 Bタンパク質の代わりにHTRA 1タンパク質を用いて実施した結合アッセイの陰性コントロールを確認できます。さて、この手順において最も重要な点の一つは、プライマーフリーのアプローチを採用していることです。これにより、固定配列が存在しないため、配列自体がランダム領域を圧倒することに起因する偽陽性や偽陰性の発生を防ぐことができます。この手順を行う際は、各逆転写反応の前にDNAテンプレートを確実に分解させること、および各再増幅後に特定のRT-PCR産物を慎重に単離させることが重要です。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。