の細胞内相互作用の可視化と定量化髄膜炎菌と人間

本実験の全体的な目的は、細胞内に取り込まれた細菌（RIA Meningitidis）と細胞骨格タンパク質であるAlpha Actininの共局在レベルを評価することです。この目的を達成するために、培養したヒト脳微小血管細胞に一晩培養した細菌を3時間から8時間感染させ、細菌を標的細胞内に進入させます。次のステップとして、細胞内細菌を含む細胞を洗浄、固定し、透過処理を行うことで、取り込まれた細菌および細胞内alpha actininの免疫染色に向けた感染培養細胞の準備を整えます。

共焦点イメージングを行い、共局在化ソフトウェアを適用することで、細胞内共局在の画像を確認できます。また、共焦点顕微鏡による可視化および定量的な共局在化解析により、Meninga Crociを発現するOPCおよび膜タンパク質が、細胞内α-actininと特異的に相互作用することが定量的な結果として得られます。こんにちは、ブリ大学細胞分子医学科のマタTI教授の研究室のIsel Mariaです。本日は、細胞内細菌と細胞骨格タンパク質の共局在比率のレベルを推定する手順について説明します。

当研究室では、自己膜タンパク質OPCを発現する髄膜炎菌の菌糸と、細胞骨格タンパク質であるα-アクチンの相互作用を研究するために、この手順を用いています。それでは、始めていきましょう。この作業は、適切な安全設備を備えた研究室で行う必要があります。

免疫染色の手順の2日前、目的の細菌株を脳心臓浸出液（BHI）培地に接種します。10%加熱馬血を添加した寒天平板を用い、免疫染色の前日に37°C、5% CO2 atmosphere下で一晩培養します。10 µLのカルチャーループを使用して、一晩培養した細菌培養液の懸濁液を作成します。

2 mLのPBSB中にて、室温で5分間静置し、大きな細菌凝集塊を沈殿させます。次に、ペレットを乱さないように、懸濁液の上層1 mLを滅菌チューブに移します。20 µLの細菌懸濁液を含む2本のバイアルに、1% SDS 0.1 M 水酸化ナトリウムを1 mL添加して細菌を可溶化し、チューブを転倒混和します。これにより細菌数を推定します。

溶液の吸光度を測定して核酸量を定量します。216に合わせ、ヒト脳微小血管内皮細胞に感染させるための感染培地における細菌懸濁液を、規定の密度に調整します。免疫染色の2日前に、12ウェルプレートのウェルに16 mmのガラスカバースリップを配置し、HBME cellsをカバースリップ上に50%コンフルエンスになるように播種します。37°C、5% CO2雰囲気下で一晩インキュベートし、翌日に移行します。

当研究室で調製した新鮮な細菌懸濁液を用いて細胞に感染させます。通常、標的細胞1個あたり200から300 colony forming unitsの感染比を用います。感染期間の終了まで、37 °C、5% carbon dioxideの条件下で3時間から8時間インキュベートします。

細胞をPBSで3回洗浄し、2%パラホルムアルデヒド500 µLを用いて室温で30〜45分間固定します。パラホルムアルデヒドを洗い流した後、PBSで希釈した0.1%Triton X 100中で10分間インキュベートし、パラホルムアルデヒド固定細胞を透過処理します。最後に、サンプルをPBSで3回洗浄し、以下に示す免疫染色の手順に進みます。次に、細胞内細菌とα-アクチニン（d-actinin）の染色は同時に行うことができます。

12ウェルプレートにおいて、透過処理済みの細胞を含むカバーガラスを500 µLの3% BSA-PBSTで30～60分間ブロッキングします。室温でPBSを用いて洗浄した後、各カバーガラスを12ウェルプレートの新しい乾燥したウェルに移動させ、細菌に対する一次抗体とalpha actininに対する一次抗体を同時に添加します。カバーガラスの表面を覆うように慎重に添加すれば、カバーガラス1枚あたり80～100 µLの抗体で十分です。室温で1時間インキュベートします。インキュベーション終了後、ウェルに200 µLのPBSを加え、カバーガラスを持ち上げて500 µLのPBSを含む新しいウェルに配置します。5分後、ピペッティングでPBSを除去し、その後、新鮮なPBSを添加します。この操作を2回繰り返し、カバーガラスを新しい乾燥したウェルに移動させます。

次に、異なる蛍光色素を標識した適切な二次抗体を1% B-S-A-P-B-S-Tで希釈し、加えます。室温・暗所で1時間インキュベートし、インキュベーション終了後、前述の方法で洗浄します。その後、DPIを用いて室温・暗所で5分間DNAを対比染色します。このインキュベーション終了後、カバーガラスをPBSで1回洗浄し、封入剤を1滴滴下して封入します。封入したカバーガラスは、顕微鏡観察まで暗所で保存してください。倒立蛍光顕微鏡に取り付けられた共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、免疫標識したサンプルの観察および画像キャプチャを行います。

CLSMの手順を開始するため、対物レンズへの浸液を滴下し、標本スライドのカバーガラスを顕微鏡ステージ上に設置します。顕微鏡を視覚モードに設定し、接眼レンズを用いて目的の領域を探します。これでLeicaソフトウェアを使用する準備が整いました。XY z取得モードを選択します。共局在解析には、512 × 512形式を選択してください。

解像度が高いほど、画像はより正確になります。次に、走査速度を向上させ、光退色を抑制するために、双方向Xモードを選択します。続いて、シーケンシャルスキャンの設定を行います。

SEC機能をクリックし、ラインの間で選択します。二次抗体に結合している蛍光色素に合わせてレーザービームを選択してください。DPIには405 nanometersを、Alexa Fluor 488には488 nanometersを、そして561 nanometersを選択します。

Trixyについて、光電子増倍管1、2、および3をそれぞれ起動します。Zスタックまたはシリーズの上限と下限を設定します。次に、Zステップサイズを0.2 micrometersに設定します。

RIA Menciusはdiplo occusであり、各caucusの直径は約0.5 micrometersであるため、Zステップサイズを0.2 micrometersに設定することで、各caucusを少なくとも2回スキャンできる確率が高まります。「開始」をクリックし、ライン平均回数を3回に選択して最終的なスキャンパラメータを設定し、信号対雑音比を向上させます。異なる波長で逐次スキャンを行い、各チャンネルにbetween linesモードを使用することで、異なる発色団間のクロストークを排除し、二重または三重染色画像を得ることができます。

2つの蛍光色素の共局在を示すには、オーバーレイ機能を選択して、選択したチャンネルを1つの画像に統合します。例えば、Alexa 488とTris-Fluor Chromesの両方が共局在している場合、オーバーレイ画像に黄色が表示されます。共局在の可能性を視覚化するために2D再構成が必要な場合は、最大投影（maximum projection）機能を用いてZスタックまたはシリーズを統合します。Zスタックまたはシリーズを取得した後、データを処理して直交画像（orthogonal image）を作成し、さまざまな要素の細胞内局在を視覚化します。

共局在の定量化は、IMP provisionのVol Cityソフトウェアを用いて行います。まず、CLSM画像を用いてライブラリを作成し、上部バーにある画像からextended focus（拡張フォーカス）を選択します。このツールにより、解析対象となる2D画像にZスタックが統合されます。

次に、COLOCALIZATIONツールを選択します。解析する2つのチャンネルは、同じ色深度である必要があります。定量化する領域を選択してください。

閾値を設定し、背景を除去します。「generate colocalization」を選択して、共局在化出力を作成します。 previouslyに選択した関心領域（ROI）に対して、共局在化統計が生成されます。

次に、マンダースの係数 R および ny を選択します。最後に、統計値を Excel ドキュメントにエクスポートしてデータ提示を行います。ここに、髄膜炎菌を 8 時間感染させたヒト脳内皮細胞の代表的な共焦点イメージング結果を示します。細菌の位置は赤色で表示されています。

α-アクチニンの位置が示される一方で、緑色の矢印は細菌の周囲に高度なα-アクチニンの蓄積が起こっていると思われる領域を示しています。このオーバーレイ画像では、黄色からオレンジ色の領域がいくつか見られ、meninga occiとα-アクチニンの共局在が示唆されています。次の画像において、感染したH-B-M-E-C単層の光学切片を作成すると、細胞の基底面に位置する細胞内細菌の周囲に共局在していることがわかります。

感染したH-B-M-E-C単層の3次元画像を処理したところ、頂端面の斜視像において、赤色の矢印で示される赤色に染色されたDurant細菌が確認され、黄色の矢印で示されるように数個の細菌が内皮細胞の基底面側に位置していました。このendon XZ断面図では、基底側に位置する明瞭なオレンジ色または黄色の部位がより明確に観察されます。一方で、内部に取り込まれた細菌と、mentonまたはactinのいずれかを標識したactinin実験では、H-B-M-E-C細胞においてactinとの共局在は時折見られましたが、fermentingとの共局在は稀であることが明らかになりました。

前回の実験で観察されたように、Retinは白い矢印で示されるいくつかの細胞内細菌の周囲に集積していました。また、相対的なオーバーラップを得るためにデータの解析を行いました。Mandaによれば、係数Rは真の共局在度（IE）を表しており、これは全画素数に対する共局在画素数の割合を示します。OPC発現髄膜炎球菌に感染したH-B-M-E-Cにおけるα-actinin、menting、およびactin全体のNY値を算出した結果、髄膜炎球菌におけるRetinのオーバーラップは25%を超えていました。

係数Yは、少量のmeningococcal信号が発生するたびに、より多量のrein信号がどの程度の頻度で出現するかを示す指標です。この指標は、内部移行したmeningococcalの近傍にα-actininが顕著に存在することを示しています。本実験では、内部移行した細菌と細胞骨格要素の共局在を視覚化し、定量化する方法を説明します。

構造の完全性を維持し、高いバックグラウンドを避けるためには、固定および免疫染色のプロトコルを厳守することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。