二重共鳴コヒーレント反ストークスラマン散乱（CARS）と生物学的構造の差イメージング

このビデオでは、コヒーレント・ラマン散乱信号を持つ生体構造に関連する2つのラマン共鳴の差分イメージングを行う手順を解説します。まず、同期させた3つの短パルスレーザーを時間的および空間的に重ね合わせます。次に、重ね合わせたパルスを標準的な倒立顕微鏡に導入することで、微小物体からコヒーレント・ラマン信号を生成させます。

生成された異なるラマン信号を比較するため、商用ソフトウェアを用いて信号を画像に変換します。その結果、二重共鳴ラマン信号と単一共鳴ラマン信号から得られた画像の差分をとることで、弱いラマン信号に対する感度が向上することが示されました。こんにちは、カリフォルニア大学デービス校バイオフォトニクスセンターのTyler Weeksです。

カリフォルニア大学デービス校のバイオフォトニクスセンターおよび内科学部のThomas ERです。本日は、化学的に特異的な細胞画像を作成するための、二重共鳴コヒーレント反ストークス・ラマン散乱を用いた手法をご紹介します。この手法を用いることで、コヒーレント反ストークス・ラマン分光法単独では直接検出できないほど弱い分子信号を検出することが可能になります。

それでは始めましょう。CARS信号とDr CARS信号を同時に生成するには、3つの波長可変で同期した短パルスレーザー光源が必要です。これらの同期パルスを得るために、まず、出力10 watts、固定波長1064 nanometers、固定パルス幅7 picoseconds、固定繰り返し周波数76 megahertzの単一短パルスレーザーから開始します。

一連の半波長板と偏光ビームスプリッターキューブを用いて、ビームを3つの部分に分割します。半波長板と偏光ビームスプリッターキューブを組み合わせることで、ビームの方向を変えずに各成分の出力を調整することが可能です。通常、2つのビームをそれぞれ約4.5 Wに調整し、3つ目のビームに残り1 Wを割り当てます。

次に、2本の高出力ビームを2つの独立した光パラメトリック発振器（OPO）に導入します。OPOは異なる周波数生成を利用して、高エネルギーの光子を異なる波長を持つ2つの低エネルギー光子に変換します。この効果を得るために使用する結晶の温度を制御することで、得られる光子の波長を0.1ナノメートル以内の精度で制御することが可能です。

これらの信号を周波数倍増させることで、1064 nanometersの固定波長レーザーを、同一の1064 nanometer光源で2つの独立したOPOを励起することにより、780 nanometersから910 nanometersの間で任意に波長可変なレーザービームに変換することが可能になります。これにより、元のポンプレーザーに自動的に同期した、独立して波長可変な2つのレーザー光源が得られます。1064 nanometerポンプレーザーからの3本目のビームは、誘電体ミラーの組み合わせによってOPOの周囲に導かれ、後で3本のビームすべてを再結合できるようにしています。

コヒーレントなラマン信号光子を効率的に生成するためには、再結合させたパルスを時間的および空間的に重ね合わせる必要があります。OPOにはリング共振器が含まれており、各レーザーパルスが結晶を複数回通過するため、OPOを通過したビームは追加の距離を移動することになり、元のポンプビームに対して大幅な遅延が生じます。この距離を補正するため、3番目のビームを用い、追加のミラーを導入してこのビームを他の2本のビームと同じ距離だけ走行させます。その後、ダイクロイックミラーを用いて再結合させ、光路長の微調整を行います。各ビームは調整可能なディレイステージに送られ、これにより異なるレーザーパルスの時間的な重なりを調整することができます。

各ビームに半波長板と偏光ビームスプリッターキューブをさらに追加し、各ビームのレーザー出力を独立して調整できるようにします。ダイクロイックミラーを使用して、まず2つのOPOからのビームを結合し、次に1064 nanometerビームを結合させますが、この際、ビームが空間的に正確に重なるように細心の注意を払う必要があります。これは、ダイクロイックミラーから数cmの位置でのビームの重なりと、ダイクロイックミラーから約1mの位置での重なりを比較することで確認できます。

高平均出力のレーザービームへの曝露はサンプルを損傷させる可能性があるため、合成された3本のビームはパルスピッカーとして機能する電気光学変調器に送られます。これにより、サンプルに到達するパルスの繰り返し周波数、すなわち平均出力を調整することが可能です。その後、合成されたレーザービームは、高開口数（NA）の対物レンズを備えた倒立顕微鏡に導入されます。高NA対物レンズによる強力な集光により、微視的なスケールでコヒーレント・ラマン信号を最も効率的に生成することができます。

顕微鏡の大物レンズはX、Y、Zピエゾステージに搭載されており、市販のビーム走査型共焦点顕微鏡と同様に、サンプル上でビームをラスタ走査することで画像を取得できます。次に、CARSおよびDRFM信号の生成方法について説明します。サンプルにおいて3本の短パルスレーザービームが相互作用すると、2本のレーザーのさまざまな組み合わせによるCARSなどの複数の四光波混合信号のほか、3本すべてのレーザーの組み合わせによる3色CARSおよびDR-CARS信号が生成されます。信号の波長が比較的近い場合、分析のためにそれらを分離することが困難になることがあります。

そのため、信号はイメージング分光器に送られます。この装置はモノクロメーターまたはバンドパスフィルターとしても機能し、異なる波長の信号を空間的に分離します。分光器内部にある電子駆動のフリップミラーを下げた位置にすると、信号は裏面照射型ディープデプリション電荷結合素子（CCD）カメラに送られます。これにより、信号範囲全体にわたる分光情報が得られ、さまざまなコヒーレント反響信号を特定および最適化して、イメージングする信号を選択することが可能になります。ベンダー提供の制御およびデータ収集ソフトウェアを使用して、分光器内のグレーティングを回転させるだけで、目的のピークをCCDカメラの中心に合わせることができます。

次に、フリップミラーの位置を変更して、信号を2番目の出口ポートへと誘導します。このポートには、単一光子計数アバランシェフォトダイオード（APD）またはフォトダイオード（PD）が接続されています。対物レンズをラスタースキャンし、APDで記録された信号を用いて、データ収集ソフトウェアで各ピクセルの光子計数率を表示させ、画像を生成します。この撮像手順を、目的とする各コヒーレント・ラマン信号に対して繰り返し、後処理で信号を比較できるようにします。

それでは、鮮明で再現性のある画像を得るために、サンプルを適切に調製する方法を見ていきましょう。サンプルの調製には細心の注意が必要です。通常、サンプルは約150 µm厚のガラスカバースリップ上で調製します。

これらのカバーガラスは十分に薄いため、本実験で使用される高NAの水浸または油浸対物レンズによる高解像度イメージングが可能です。代表的な試料の調製手順を示すため、顕微鏡スライドに固定した厚さ約20 micronのマウス筋肉組織切片を調製します。ここに5 molarの重水素化グルコース溶液を20 microliter滴下します。

重水素化グルコース溶液は、ユニークで強力なラマンバックグラウンドシグナルを提供します。サンプルの上にガラスカバースリップを配置し、細胞および培養用のマニキュアで固定します。ガラスボトム培養皿を使用すれば、細胞を培養皿から剥離させることなくイメージングが可能です。

次に、DRCSにおける適切なラマンピークの決定方法について説明します。二重共鳴増強効果を適切に活用するためには、両方のラマン共鳴物質のラマンスペクトルを把握しておく必要があります。通常、脂質に関連する 2,845 cm⁻¹ と、重水素化グルコースのCD伸縮モードに関連する 2,121 cm⁻¹ が用いられます。

コヒーレント・ラマン散乱は、2つのレーザー間の周波数差が分子振動の周波数と一致したときに達成されます。一方のOPOを817ナノメートルに調整し、1064ナノメートルのレーザービームと組み合わせることで、2,845 inverse centimetersのCモードをプローブします。また、もう一方のOPOを868ナノメートルに調整し、1064ナノメートルのビームと組み合わせることで、2,121 inverse centimeterをプローブします。分光モードにおいて、顕微鏡を用いることで、注目すべき3つのコヒーレント・ラマン信号、すなわちCH伸縮振動をプローブするCAR信号、CD伸縮モードをプローブするCAR信号、およびその両方をプローブするDR CAR信号を観察することが可能です。ここに示す図において、破線矢印はOPO内のレーザーからの光子を、実線矢印は得られた信号を示しています。

実線の水平線はラマン振動のエネルギーを示しており、DRカーでは同じ3つの入力光子を混合することで、2つの異なるラマン振動を同時にプローブできることを視覚的に表しています。各ピークの信号強度は、これらのピーク位置周辺で微細なステップで調整し、最適化する必要があります。ここでは、各ピークを選択して、低濃度のグルコース溶液中の *Caenorhabditis elegans* の画像を撮影します。これらの個別に得られた3枚の画像に基づいて追加情報を抽出するには、非常に単純な画像処理が必要です。

まず、画像を正規化する必要があります。正規化の実用的な手法は、脂質が疎水性であるという事実に依拠しています。これは、脂質の高密度領域では、グルコース由来のCD共鳴が二重共鳴信号にほとんど寄与しないことを意味します。

逆に、純粋なグルコース溶液の領域では、脂質由来のCH共鳴の寄与も非常に小さいはずです。これを踏まえ、DR画像および重水素化グルコース溶液のCD共鳴で得られた画像を、CH共鳴を示さないはずのC. elegansの虫体から十分に離れた領域で正規化します。次に、CH共鳴画像において脂質が豊富な虫体内の領域を特定し、正規化されたDR画像の対応する領域に合わせて正規化します。

この手法を適切に機能させるため、この領域の深部には重水素化グルコースが存在しないと仮定します。脂質は疎水性であり、溶液と混ざり合わないため、これは妥当な仮定です。ここで、正規化されたDR CAR画像から正規化されたCH共鳴CAR画像を差し引くと、増幅されたCD共鳴信号のみが残ります。同様に、正規化されたDr.FWM画像から正規化されたCD共鳴CAR画像を差し引くことで得られます。

増幅されたCH共鳴信号のみが表示されています。ここに示されているのは、アルキン修飾を含む修飾オレイン酸のラマンスペクトルです。2,845 cm⁻¹における強いCH共鳴と2,121 cm⁻¹におけるアルキン共鳴はいずれも、ピークが密集するフィンガープリント領域から十分に分離されており、コヒーレントラマンイメージングの理想的なマーカーとなります。これは、3本の短パルスレーザーを試料内で重ね合わせた際に生成される、典型的なコヒーレントラマン信号のスペクトルです。矢印は、エネルギー図で示される各信号の原因となるプロセスを指しています。

これらは、DR CARSおよびCARSを用いてC. elegansをイメージングした際の代表的な結果です。上段では、先ほど示した3つの信号を使用して、低濃度グルコース溶液中の線虫をイメージングしています。中段では、画像が適切に規格化されており、下段では、DR CARSの画像から各CARSの画像を差し引くことで差分画像を作成しました。以上で、二重共鳴コヒーレント反ストークスラマン顕微鏡法に基づくラマン差分イメージングの実施方法を説明しました。

この手順を行う際は、ビームが適切に重なり、同期していることを確認することが重要です。また、異なるコヒーレント信号を切り替える際は、分析に影響が出るため、サンプルに衝撃を与えたり動かしたりしないように注意してください。以上です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。