マウス膵島の単離と被膜下腎移植のための方法

膵島移植は、1型糖尿病の潜在的な治療法として提案されています。しかし、広範な臨床応用を実現する上で2つの大きな制限があります。第一に、レシピエント1人あたりに大量の膵島が必要となることです。

アイレットは臓器ドナーから提供されるため、潜在的なレシピエントの数は極めて限定的です。2度目の移植には強力な免疫抑制剤による生涯にわたる治療が必要であり、これは患者、特に小児集団において、悪性腫瘍、感染症、および腎不全のリスクを伴います。臨床的な移植成績を向上させるための戦略を研究するため、マウス腎被膜下へのアイレット移植が行われます。

健康なドナーマウスから分離したアイレットをグループ分けし、移植の準備を行います。その後、アイレットを腎臓の被包下に移植します。糖尿病のレシピエントマウスにおけるアイレット移植片の機能は、血糖値のモニタリングによって評価されます。その結果、20 gのレシピエントマウスにおいて、約250から350個のアイレットを移植すれば、24時間以内に血糖値が正常に回復することが明らかになります。

カニューレ挿入の手順において、この手法を視覚的に提示することは極めて重要です。総胆管への挿入およびアイレットの腎被膜下腔への移行は、習得が困難な操作です。これらのステップでは、組織構造の正確な識別、安定した手技、および組織損傷を最小限に抑えるテクニックの使用が求められます。

安楽死させたマウスを解剖顕微鏡下のペーパータオルの上に仰向けに置き、腹部に70% ethanolをスプレーします。ハサミを使用して、恥骨領域から両前肢にかけてV字に切開し、腹部を開きます。マウスは解剖顕微鏡の下に配置されています。

頭部が観察者側に向くように配置します。止血鉗子を用いて、総胆管の十二指腸への流入部、すなわち総胆管の十二指腸開口部を特定します。止血鉗子は、閉じた際に膵臓と腸の境界に正確に沿うように配置してください。

ここでは、胆管をカニュレーションする2つの方法を実演します。胆管をカニュレーションするためのフリーハンド法と、鉗子補助法です。フリーハンド法を用いる場合は、十二指腸にクランプした止血鉗子を、マウスの頭側から尾側へ引き、総胆管を緊張させます。

肝臓に近い胆管には、胆嚢から排出される胆汁と肝臓からの酵素が合流する部位があります。腸に入る前に、胆管を強く引っ張り、V字部位の内側を露出させます。5 mLのシリンジに取り付けた曲げた27ゲージの針を使用し、針をV字部分に沿わせて滑り込ませ、胆管の下部を直接カニューレします。肝臓や胆嚢への逆流を防ぐため、針を刃先の先端から数mm先まで挿入してください。

カニュレーションが成功したら、シリンジから2 mLのliaseを注入して膵臓を灌流させます。膵臓が胃の上で膨張することを確認し、カニュレーションが最適に行われたか判断します。あるいは、胆管をカニュレーションすることも可能です。

鉗子嚢胞法を用います。十二指腸に固定した止血鉗子Cを、マウスの頭側から尾側に向かって引き、総胆管を屈曲させます。次に、5mLシリンジに取り付けた曲げた27ゲージの針を用いて、肝臓に近い総胆管下の筋膜を穿刺します。

針を刺したまま、針を用いて管から筋膜を取り除きます。止血鉗子を置き、ピンセットを持ちます。ピンセットを開いた状態で、片方の先端で針によって筋膜が取り除かれた胆管を支持しながら、胆管とピンセットを前方へ牽引します。

ピンセットを背後のストッパーとして利用し、針を管の中に滑り込ませます。胃の上の膵臓領域が均一に拡張していれば、カニューレ挿入が成功したことを示しています。膵臓への灌流が完了したら、十二指腸から止血鉗子を取り除きます。

次に、ピンセットで十二指腸を持ち上げ、もう一本のピンセットを使用して膵臓を腸から分離します。続いて、膵臓を胃の上部および脾臓から引き離します。最後に、膵臓を腹腔内から持ち上げ、腸、胃、および脾臓に残っている筋膜の結合部を切断して取り出します。

膵臓を50 mLのコニカルチューブに入れ、氷上に置きます。付属の書面プロトコルの指示に従い、膵臓を37 °Cでインキュベートします。インキュベーション後、チューブに20 mLの培地を加え、チューブを10秒間に40回激しく振ることで組織を解離させます。

このステップは、バイオレットを最適に回収するために極めて重要です。細胞を800 rpmで遠心分離します。15 mLの培地で再懸濁し、サンプルを濃縮します。

再懸濁したスラリーを0.419 millimeterのワイヤーメッシュに通し、新しい50 milliliterコニカルチューブにろ過します。最初のチューブを10% fetal bovine serumを含む培地10 millilitersで洗浄し、同様にワイヤーメッシュに通します。遠心分離により細胞をペレット化し、室温のHistopaque 1077 5 millilitersでペレットを再懸濁します。その後、数秒間緩やかにボルテックスし、さらに5 millilitersのHistopaqueを追加し、チューブの内壁に付着した細胞を洗い流します。血清不含RPMI 10 millilitersを、10秒あたり1 milliliterの速度でチューブの壁面に沿ってゆっくりとピペッティングし、オーバーレイします。

明確な界面が確認できるはずです。次に、スイングバケット式遠心機を用い、20 °C、900 ×g で20分間、加速を非常に緩やかにし、遠心後ブレーキをかけずに回転させます。遠心後、使い捨ての 10 mL セロロジカルピペットを使用して、膵島を外分泌細胞から分離します。HistoPaque 培地の界面から膵島を回収し、新しい 50 mL コニカルチューブに移します。

この時点で複数のチューブをまとめ、残留した眼窩組織を除去します。血清含有培地で不透明なチューブを満たし、800 rpmで2分間遠心分離してアイレットをペレット化します。その後、アイレットを新鮮な培地で再懸濁します。この手順を少なくとも2回繰り返します。

ペレットを5 mLの培地に懸濁させる。0.1 mmのナイロンセルストレーナーを15 mLコニカルチューブの上に逆さまに設置する。再懸濁した細胞スラリーをストレーナーに通して、アイレットを回収する。

次に、50 mLチューブをさらに6 mLの培地で洗浄し、ストレーナーに通します。10 cmペトリ皿に培地を3 mL滴下します。セルストレーナーを逆さまにして培地の滴に浸し、アイレットを回収します。さらに5〜7 mLの培養液をストレーナー経由でペトリ皿にピペッティングします。

4倍対物レンズ下でストレーナーに残っているアイレットを回収するため、P 200ピペットでアイレットを個別に吸い上げ、1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。これらの画像は、12週齢のC 57black/6マウスから単離したアイレットを示しています。単離手順の完了後、顕微鏡下でアイレットの純度と品質を推定することができます。

例えば、ここに示す2つの画像は、デブリや外分泌細胞の混入がある代表的な視野を示しています。実験用のアイレットを選択する際は、混入している外分泌細胞や、不健康に見えるアイレットを避けて選択してください。分離から24時間後に撮影したこの図に示すように、中心部が壊死しているアイレットは不健康な状態ですが、壊死した中心部は分離直後には確認できません。

細胞が脱落しているアイレットは避けられませんが、このアイレットの24時間タイムラプス動画に示すように、アイレット移植に使用することが可能です。単離直後、多くのアイレット内で壊死中心が形成されます。アイレットをピッキングしている際、記録の終盤に向けて、これらの壊死中心がアイレットから排出される様子が見られます。

各チューブにアイレットの品質とサイズが均等に分散するようにグループ分けします。例えば、15個のアイレットの各グループに、大サイズを4個、中サイズを6個、小サイズを5個含めるようにします。チューブを氷上に置き、アイレットを直ちに移植に使用するか、あるいは操作に用います。

使用前に、滅菌済みのゲルローディングチップを1.5 mLマイクロチューブの開口部に挿入します。この際、チップの狭い端が緩やかに曲がり、U字型になるようにしてください。チップの両方の開口部が、マイクロチューブから直接上を向いている必要があります。

氷からアイレットが入ったチューブをゆっくりと取り出します。すべてのアイレットがチューブの底に沈んでいることを確認してください。P 200 ピペットを使用して、チューブの底から最小限の量でアイレットを静かに回収し、用意した曲がりチップに転送します。

アイレットが沈降した後、アイレットが入ったゲルローディングチップの広い開口部から培地を吸引し、チップ先端から可能な限り多くの培地を除去します。この際、P 200 ピペットに新しいゲルローディングチップを取り付けて使用してください。チューブの面取りされていない端を、アイレットが入ったゲルローディングチップの狭い開口部に接続します。その後、チップを P 200 ピペットに取り付け、アイレットをチューブの中にゆっくりと押し出します。

次に、PE 50チューブの面取りされていない端を、25 µLのハミルトンシリンジの針に接続します。プランジャーを引き出した状態で、アイレットが面取りされた開口部から約0.5 cm離れるまで、シリンジのプランジャーを押します。腎臓にアイレットを導入する準備が整うまで、アイレットがチューブの面取り開口部付近で一つの塊として落ち着くように、シリンジを置いておきます。

被毛をクリッピングし、ベタジンと70% isopropyl alcoholを交互に3回使用して皮膚を洗浄し、手術部位を準備します。レシピエントマウスの足指を挟んで麻酔状態を確認し、アイレット移植の手順を開始します。ガラス棒のシャフトをマウスの直下、脊髄に対して垂直かつ腎臓の下に配置します。

次に、皮膚越しに腎臓の位置を確認し、滅菌手術用ドレープを掛けます。腎臓の位置を特定した後、McFerson banis 鋏を用いて、腎臓の直上の真皮を脊髄に対して垂直に 2 cm 切開します。この切開により、鋏で腹膜壁が露出します。

ガラス棒のシャフトを支えにして、皮膚層の切開と同じ方向に腹膜壁を1cm切開します。隣接する表面を押し下げ、腹膜の開口部から腎臓を押し出します。浸した綿棒を用いて、露出した腎臓の表面を氷冷滅菌PBSで湿らせます。腎被膜の乾燥を防ぐため、必要に応じて数分ごとにこの操作を繰り返します。

27ゲージの針を用い、腎臓前面の腎被膜に0.2 cmの切開を加えます。左外側から右外側に向かって、火炎延伸したガラスキャピラリーチューブを挿入します。先に作成した切開口からプローブし、腎臓の背外側表面に沿って後方に移動させます。

腎被膜と腎実質の間にポーチを作成するため、準備した25 milliliterのHamiltonシリンジ内のアイレットを、フレキシブルチューブのベベル開口部の端まで移動させます。次に、ベベル端を上向きにして被膜下ポーチに挿入します。このとき、長い方の端が腎実質に接するようにします。

チューブをカプセルの最も後方に移動させます。次に、シリンジのプランジャーを押し下げ、PE 50チューブからサブカプセルポーチへアイレットをゆっくりと移動させます。アイレットでポーチが満たされたら、よりスペースを確保するために、フレキシブルチューブをゆっくりと後退させます。

ポーチからチューブを取り出した後、ガラスプローブを腎臓の外表面に沿って前から後ろへと滑らせ、アイレットをポーチの近位端に緩やかに詰め込みます。曲がり鉗子を用いて、腎臓のために作った開口部付近の腹膜を lifts します。次に、PBSに浸した綿棒を用いて、腎臓を腹腔内にゆっくりと押し戻します。

腹壁を縫合し、皮膚層をウィンドウクリップで固定してマウスを閉鎖します。マウスをケージに戻し、経過を観察します。回復のため、マウスの飲用水として酢酸水を供給してください。

分離したCマウスのアイレットを、本ビデオで説明した方法を用いて、同種C 57 black sixマウスに治療量移植しました。術後1日目より、非空腹時血糖値をモニタリングしました。

同種ドナーから300個のアイレットを移植した20gのレシピエントマウスでは、17日目付近で拒絶反応が認められます。同系ドナーから150個または300個のアイレットを移植したマウスにおいて、回復状況のモニタリングを行いました。これらの移植では、アイレットが同系ドナー由来であるため、拒絶反応は見られません。

投与されたアイレットの用量は、移植直後のアイレットの主要な機能を測定する指標となります。150個のアイレットでは不十分な回復しか見られませんでしたが、300個のアイレットを移植した場合には完全な回復が認められました。このビデオを視聴することで、マウスアイレットを単離し、それらを腎臓の被膜下腔に移植するために必要な重要な手順を適切に実行する方法を十分に理解できるはずです。

練習を重ねることで、本プロトコルで最も困難な工程である総胆管へのカニューレ挿入を迅速に行えるようになります。