グラミシジンベースの蛍光アッセイ、脂質二重層のプロパティの変更の可能性小分子を決定するための

本手順の全体的な目的は、二重層貫通タンパク質によって感知される、薬物誘発性の二重層特性の変化を測定することです。これは、まず蛍光物質を封入した大型の単層小胞（LUV）を作製することによって達成されます。手順の第2段階は、これらの小胞にグラミンを添加することです。

手順の3番目のステップは、外部クエンチャーを添加し、内部蛍光物質の消光速度を測定することです。4番目の最終ステップでは、蛍光の時間経過に伸張指数関数をフィッティングさせることで、gramin活性あたりの蛍光消光の変化量を定量します。最終的に、amfiファイルが脂質二重層の特性を変化させ得るかどうかを評価するための結果が得られます。

こんにちは、オラ・アンダーソンです。こんにちは、ヘルソンです。こんにちは、リッチー・カポです。

私は、ウェイル・コーネル医科大学生理学・生物物理学部のOlaf Anderson博士の研究室に所属しているLeah Sanfordです。本日は、脂質二重層の特性の変化を測定する手順をご紹介します。私たちの研究室では、この手順を用いて、薬剤や低分子が脂質二重層の特性に及ぼす影響を研究しています。

それでは始めましょう。本手順の1日目に、脂質をフリーザーから取り出し、室温に戻します。室温に達したら、25 mg/mLの脂質およびクロロホルム溶液0.6 mLを25 mL丸底フラスコに加えます。次に、クロロホルムがすべて蒸発するまで、フラスコを絶えず回転させながら窒素ガス下で溶液を乾燥させます。

また、脂質の薄い白い膜がフラスコの下半分全体を覆っています。この脂質をデシケーター内で真空状態で一晩さらに乾燥させます。100 mM硝酸ナトリウム、25 mM ANTS、およびpH 7の10 mM HEPsを含む溶液を調製します。この溶液のpHを調整する際は、塩化物を含む溶液を一切使用しないでください。

タリウムクエンチャー（Quencher）が2日目に塩化物と不溶性複合体を形成するため、1.67で脂質を再水和させます。この電解質溶液を1 mL加え、10 mMの脂質懸濁液にします。正しい濃度に達したら、パラフィルムで蓋をして懸濁液を十分にボルテックスし、サンプルをアルミホイルで遮光して、室温で一晩静置します。

3日目に、低出力のソニケーターで混合物を1分間処理します。次に、ドライアイスで5分間凍結させ、続いて温水で5分間融解させることでサンプルの凍結融解を行い、このサイクルを4〜5回繰り返します。Avanti mini extruderを用いて、脂質懸濁液を押し出します。

0.1 µmのポリカーボネートフィルターとフィルターサポートを用いてミニエクストルーダーをセットアップし、懸濁液を21回往復してエクストルージョンを行い、ほぼ半透明の懸濁液が反対側のシリンジに入るようにして、大単層小胞（LUV）懸濁液を作成します。ナトリウム緩衝液で平衡化したPD 10脱塩カラムに、エクストルージョン後の懸濁液を流し込み、外部のANTSを除去します。LUV懸濁液1.5 mLとナトリウム緩衝液1 mLをカラムに加えます。

溶液がカラムに完全に浸透した後、3 mLのナトリウム緩衝液でリポソームを溶出し、溶出液を回収します。得られたA NTS充填LUVストック溶液は、脂質濃度が約4〜5 mMであり、乳白色の半透明に見えるはずです。

溶液をホイルで遮光し、13 °Cで保存してください。使用する24時間前に、A NTS充填LUVストック溶液を十分にボルテックスしてください。UUVは密度が1 g/mLより大きいため、沈殿することがあります。

次に、A NTSを充填したLUVストック溶液をナトリウム緩衝液で1:20に希釈します。リポソームの4分の3を、DMSOに溶解した260 nanogramのabidinとともにインキュベートします。残りの4分の1には、graminを含まない同量のDMSOを加えます。

すべてのサンプルで溶媒濃度を一定に保つため、グラミンを13°Cで24時間放置し、脂質小胞の内層および外層の単分子層間で平衡化させます。ここでは、温度制御機能を備えたApplied Photophysics SX point 20ストップフロー分光蛍光光度計を用いて、蛍光消光速度を測定します。測定を開始する1時間前に装置の電源を入れ、ウォームアップを行ってください。

励起用のスリット幅は1/1とし、pro data SXソフトウェアを用いてエミッションを記録する際は、455 nmのハイパスフィルターを使用してください。まず記録条件を設定し、モノクロメーターの励起波長を352 nmに設定します。プレッシャーホールド設定を使用してください。

時間を1秒に、ポイント数を5,000に設定します。リピート回数は、バッファーランでは9回に、クエンチャーランでは13回に調整してください。Essexソフトウェアのチェックドライブプロファイルで温度を監視します。

ドライブボリュームは120 µLに設定してください。これにより、各シリンジから60 µLずつ混合されます。このときのデッドタイムは約1.2 msとなります。蛍光検出器の高電圧またはゲインを約420 Vに調整してください。

目的は、約8の蛍光強度を得ることです。事前に調製したNTS負荷UUVを、暗所で25°Cで10分間平衡化します。平衡化後、サンプルをボルテックスし、左側のシリンジに充填します。右側のシリンジには、ナトリウム緩衝液または thallium.Quencher のいずれかを充填します。

シリンジを前後に動かして、気泡を完全に取り除きます。両方のシリンジに等量ずつ充填してください。最初のサンプルを導入してバルブを閉じる前に、ナトリウム緩衝液を用いて蛍光を記録します。

これを4回繰り返し、必要に応じてゲインを調整します。その後、残りのサンプルに対してさらに5回繰り返します。ナトリウム緩衝液を用いて9回の繰り返し測定を記録してください。

ナトリウム緩衝液をタリウムクエンチャーに交換し、13回の繰り返し測定を行う。水で洗浄し、次のサンプルコントロールの手順に進む。グラミンを含まない溶媒のみのサンプル、およびグラミンを含まず最大化合物濃度となるサンプルを含めること。

続いて、グラミンと溶媒の両方で蛍光アッセイを行い、データをMATLABソフトウェアに取り込んで解析します。読み込んだ各サンプルのすべての緩衝液およびクエンチャーの繰り返し測定において、最初の4回の繰り返しは、チューブ内に以前に残っていた成分によって汚染されます。この場合、シグナルはナトリウム緩衝液サンプルが前回の洗浄による水と混ざり合うことで発生します。

5回目から9回目の繰り返しは、サンプルのみからの信号を表します。したがって、いずれの場合も最初の4回の繰り返しは常に除外します。ミキシングによるアーティファクトを避けるため、トレースを手作業で確認し、ミキシングのアーティファクトや気泡に起因するスパイクや偏差を含む赤色のトレースなど、不良な繰り返しを除去してください。

次に、各実験条件の各サンプルについて、クエンチャー（消光剤）の繰り返し測定値をバッファーの繰り返し測定値の平均開始値で正規化し、すべてのサンプルの平均値を1つのグラフにまとめます。グラミンを含まない可視化サンプルはすべて同様の結果となり、蛍光消光はほとんど見られないはずです。グラムシジンを含むサンプルでは、タリウムイオンが徐々に小胞内へ浸入するため、蛍光信号が緩やかに減少します。蛍光のタイムコースが化合物によって目に見えて変化している場合、その化合物はテストした濃度において脂質二重層の特性を変化させていることになります。次に、正規化した蛍光消光曲線の最初の2〜100ミリ秒に対して、伸張指数関数をフィッティングさせます。

個々のリピートについて、2ミリ秒における速度を算出します。次に、個々のリピートから、特定のサンプルの平均値と標準偏差を算出します。ここでは、gramin（gaと表記）の不在下または存在下における、カプサイシン（capと表記）が蛍光消光のタイムコースに及ぼす影響を観察しました。正規化された蛍光信号を1秒間で示しています。灰色の点はすべてのリピートの結果を表し、赤線は平均値を示しています。

規格化された蛍光信号の最初の100ミリ秒を示しています。灰色の点は、各条件における1回ずつの繰り返し測定の結果です。赤線は、それらの繰り返し測定に対する伸長指数関数近似（stretched exponential fit）です。

点線の青い線は2ミリ秒の時点を示しています。これは消光速度を決定する時間です。消光速度の相対的な変化は、修飾剤を含まずグラミンのみを用いたコントロールサンプルでデータを正規化することによって決定します。

カプサイシンが脂質二重層に吸収されると、二重層の特性が変化します。より柔軟な二重層への変化は、モノマー・ダイマー平衡において、伝導性ダイマーに有利な方向へのグラム側のシフトとして反映されます。以上で、低分子による二重層への摂動効果を測定する手順について説明しました。

この手順を行う際は、同一バッチのベシクルを用いて、各実験に適切なコントロールを設定することを忘れないでください。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験が成功することを願っております。