EDU信号増幅による個別細胞におけるミトコンドリアDNAの複製の可視化

本手順の目的は、培養ニューロンにおけるmtDNA複製を標識し、可視化することです。まず、ニューロンをチミジンアナログであるEDUとともに2〜24時間インキュベートします。次に、銅触媒による共有結合反応を用いて、アルキンを含むEDUを蛍光色素Oregon Green 488 azideで標識します。

手順の最終ステップは、新たに合成されたMT DNAに取り込まれたEDUを可視化するために、アラミド信号増幅ステップを用いてオルゴン 그린信号を増幅させることです。最終的に、クリック EDU 化学とそれに続くティアマインド信号増幅を組み合わせることで、ニューロンの特定の細胞内区画におけるMT DNA複製を示す結果を得ることができます。BRDU ラベリングなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、EDU ラベリングの方がより簡便かつ低刺激であり、ニューロンマーカーの追加の免疫蛍光染色が可能である点にあります。

本手法は、細胞体、軸索、樹状突起、およびシナプス末端を含むサブセルラーコンパートメントにおいて、ニューロンが変化するエネルギー負荷にどのように対応しているかなど、ミトコンドリア数の調節に関する重要な問いに答えることができます。したがって、本手法は、ニューロパチーや神経変性を含む、ミトコンドリアを基盤とする多くの神経疾患の病態生理の根底にあるメカニズムへの洞察を提供できます。さらに重要なことに、薬物毒性、がん、老化など、ミトコンドリアDNAコピー数の変化が疾患状態の病態生理の根底にあると考えられる他の系にも適用可能です。

このビデオでは、滅菌済みの12 mmガラスカバースリップ上で培養した後根神経節ニューロンにおいて、新たに合成されたミトコンドリアDNA（略称：M-T-D-N-A）をラベルする方法を実演します。24ウェル培養プレート内で、Click-iT EDU Microplate assay kitに含まれる10 mM 5-エチニル-2'-デオキシウリジン（略称：EDU）ストック溶液を、培養培地で1対100に希釈して10X EDUストック溶液を調製します。次に、この10X EDUストック溶液を各ウェルの培地に直接添加します。処理したニューロンを、ドラフトチャンバー内で37 °C、5% CO2の条件下で2〜24時間インキュベートしてください。

ニューロンを2%Paraform aldehydeで室温にて10〜15分間固定します。1 XPBSで2〜5分間ずつ2回洗浄します。固定したニューロンは、新鮮な1 XPBS中で4°Cにて最大1か月間保存可能です。

付属のテキストに従い、加湿チャンバーを準備します。先端の細いピンセットを使用して、ポジティブおよびネガティブのEDUコントロールを含む、固定済みのカバーガラス28枚を、加湿チャンバー内の疎水性パラフォームMのシート上に移動させます。各カバーガラスの表面を覆うように、1XPBSを200〜300 µL再添加します。

本文および製造元の説明書に従ってClick-itアッセイキットを調製し、1XPBSに0.1% Triton Xを含む透過化溶液 75〜80 µLを各カバーガラスに加えてミトコンドリアDNAを標識し、室温で10分間インキュベートします。細胞を流失させずに液体を穏やかに除去するため、200 µLチップを先端に装着したバルブトランスファーピペットを使用してください。

バルブピペットを使用して、カバーガラスに緩やかに液を満たします。1X PBSを200〜300 µL滴下し、前の溶液を完全に洗い流します。各カバーガラスを2回洗浄してください。

新鮮な1%過酸化水素を含む1 XPBSを75～80 µL、各カバースリップにピペッティングします。内因性ペルオキシダーゼ活性を消去するため、カバーをして室温で30分間インキュベートします。前述と同様に1 XPBSで2回洗浄し、付属テキストに詳述されている手順に従ってクリック反応カクテルを調製します。

ピペッティングにより上下に混ぜ合わせます。ボルテックス処理は行わないでください。カバースリップ1枚につき75〜80 µLのClick-iT EDU固定液を加え、神経細胞を後固定し、室温で5分間インキュベートします。後固定のインキュベート中に、反応カクテルを等量のClick-iT EDU固定液で希釈します。

各カバーガラスに反応カクテルを加え、遮光して室温で25分間インキュベートします。エピ蛍光顕微鏡下で、反応カクテルを穏かに除去し、希釈した1xブロッキングバッファーで2回洗浄します。EdU染色の完了後、核におけるOregon Green染色の有無を確認してください。

TSA（ターミナイト信号増幅法）を開始するため、各カバースリップに1% TSAブロッキング溶液を加え、室温で30分間インキュベートします。あらかじめTSAの2〜24時間前に調製しておいた抗Anti-NE Green horseradish peroxidase（西洋わさびペルオキシダーゼ）結合抗体ストックを軽くスピンダウンさせます。一次抗体をTSAブロッキング溶液で1:300に希釈し、転倒混和またはピペッティングで混ぜ合わせます。ボルテックス（攪拌機）は使用しないでください。各カバースリップに75 µLを加え、4°Cで一晩インキュベートします。

翌日、室温でXPBSを用いて3回洗浄します。未結合の一次抗体を確実に除去するため、最後の洗浄液にカバーガラスをさらに30～60分間浸漬させます。使用直前に、本プロトコルの本文に従ってIDE反応液を調製してください。

カバーガラスをIDE反応液とともに室温で15分間インキュベートします。XPBSで3 times洗浄し、前述と同様に顕微鏡下で最後の洗浄液中で30〜60分間インキュベートします。MT DNAのラベル化を確認し、DPIを含むANTIFA封入剤を用いて、染色に成功したニューロンをガラススライドに封入します。ここに示しているのは、解析に通常用いられる胚および成体の後根神経節ニューロンの代表的な微分干渉コントラスト（DIC）像です。

これらの概略図は、MTD NAにおけるEDUを緑色蛍光シグナルで標識する手順を示しています。有糸分裂活性のあるF 11神経芽細胞腫細胞をポジティブコントロールとして使用し、これらの代表的な明視野重ね合わせ蛍光画像において、核およびミトコンドリアDNAに取り込まれたEDUの標識パターンを示しています。緑色の点状のシグナルは、胚および成体の後根神経節ニューロンの両方において、新たに合成されたM-D-D-N-Aに取り込まれ、増幅されたEDUシグナルを示しています。

EdUラベルの手順により、その後、ニューロフィラメントなどの神経マーカーを赤色の免疫蛍光染色することが可能です。これらの模式図は、EdUおよびMTD NAを赤色蛍光シグナルで標識する手順を示しています。有糸分裂活性を持つF 11神経芽細胞腫細胞をポジティブコントロールとして用い、核およびミトコンドリアDNAに取り込まれたEdUの標識パターンを示しています。

この概略図は、新たに合成されたM-T-D-N-A中のBRDUを、緑色または赤色の蛍光シグナルで標識する手順を示しています。この手順を行う際は、増幅ステップに進んでMT DNAの標識を可視化させる前に、有糸分裂活性のある細胞を用いてコントロールを行い、EDU標識および細胞核が正常に確認できるかチェックすることが重要です。本手順に加えて、標準的な免疫蛍光染色などの他の手法を用いることで、神経細胞の特定のサブポピュレーションや神経細胞区画においてミトコンドリアDNA合成がどのように制御されているかなど、さらなる疑問に対する検討が可能です。本手法の開発により、神経生物学分野の研究者が、正常な生理学的状態の培養モデルおよび疾患による機能不全を模倣した培養モデルの両方において、ミトコンドリア数の調節を探索するための道が開かれることになります。

神経学的状態。