実験的自己免疫性下垂体炎の誘導のためのマウス下垂体免疫原の調製

自己免疫性下垂体炎は、下垂体の腫大と1つまたは複数の下垂体ホルモンの欠乏を特徴とします。原因となる自己抗原は依然として不明です。ここでは、この疾患の研究に使用するためのマウス下垂体タンパク質を調製するプロトコルを紹介します。

まず、安楽死させたマウスから下垂体を単離します。次に、下垂体をホモジナイズして細胞を機械的に破壊し、細胞質タンパク質を放出させます。ホモジネートを低速遠心分離で清澄化し、BCA法による比色定量法で量を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で質を評価します。

最後に、水溶性のタンパク質ホモジネートをオイルアジュバントと混合します。この混合液をマウスに注射し、自己免疫性下垂体炎に類似したマウスモデルを作製します。付随するビデオに示されているように、実験動物に下垂体炎を誘発させるための4つの手法が報告されています。

本記事で紹介する下垂体タンパク質混合物とインフルエンザアジュバントを注入する手法は、1960年代まで遡る最も古い手法です。その他のアプローチとしては、1992年のルベラウイルス由来の可溶性糖タンパク質の注入、2002年の下垂体へのアデノウイルスの直接定位注入、そして2010年のあるラット系統の下垂体を別のラット系統の腎被膜下に移植する方法があります。フロレンスのアジュバント法による主な利点は、現代において侵襲性が低く、再現性が高く、そして何よりも、ヒトの疾患に極めて近い疾患を誘導する精度が高いことです。

1960年代から報告されているものの、下垂体炎を誘導するための異種アジュバント法は十分な成果を上げていませんでした。私が博士課程の研究を始めた際、既報の異種アジュバントプロトコルを用いては、下垂体炎の発症率および重症度は限定的なものでした。しかし、エマルションに含まれる下垂体タンパク質の量を10倍に増やすという着想を得たことで、状況は大幅に改善されました。

この手法は自己免疫性下垂体炎の病態生理に関する知見を提供しますが、自己抗原が未同定である他の自己免疫性疾患の研究にも応用可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、手技的なスキル、時間、そして集中力が必要となる最後のステップであるマージンの調製に最も苦労します。したがって、適切なエマルションをどのように調製すべきかを理解するためには、視覚的なデモンストレーションが極めて重要です。

この手法の意義は、自己免疫の分野に留まりません。免疫のための抗原調製法を習得することは、モノクローナル抗体の作製や新しいワクチンの試験にも応用可能です。本手法の実演は、私の研究室のS Zoo heroic UraおよびMayland al gatoが行います。

マウスの下垂体は円筒形の腺であり、頭蓋底にある蝶形骨の陥凹（トルシカ）に位置しています。この腺は、外側を三叉神経に、前方を視神経交叉に囲まれています。下垂体は、より大きな前葉と、より小さな中葉および後葉で構成されています。

下垂体を単離するには、はさみを用いて安楽死させたマウスの頸部を切断し、頭蓋骨の後方から前方に向かって平行に切開します。脳を持ち上げて後方に反転させ、下垂体を露出させます。下垂体は、下垂体自体を底辺、三叉神経を両辺、視神経交叉を頂点とする二等辺三角形のような形状の中に、円柱状に現れます。

閉じたピンセットの先端で腺の周囲を円状に囲むようにし、周囲の髄膜を破ります。次に、微細ピンセットを用いて下垂体をトルコ鞍から取り出し、ドライアイス上のプラスチックチューブに入れます。1回の調製につき、マウス下垂体を300個回収してください。

この採取作業には約9人時を要します。採取完了後、下垂体は使用時まで-80°Cで保存してください。15 mLのFalconチューブを氷浴に置きます。

チューブに250 µLのホモジナイズ緩衝液を加えます。ホモジナイズ直前に回収した下垂体100個につき、マウス下垂体を緩衝液に加えます。次に、マウス下垂体と緩衝液が入ったFalconチューブの底に、直径5 mmのジェネレーターを備えたポリトロンホモジナイザーのチップを設置し、最大速度で30秒間ホモジナイズします。

チューブを氷上に置いたまま、ゆっくりと上下に動かします。その後、ホモジネートを氷上で1分間静置します。ホモジナイズと冷却の工程をさらに2回繰り返します。

この緩やかなホモジナイズにより、核を破壊することなく細胞を破砕し、タンパク質を放出させます。ホモジナイズした液を、4 °Cで約1000 Gの低速で10分間遠心分離し、核、未破砕組織、および結合組織や変性タンパク質複合体などの不溶性物質を沈殿させます。その際、ペレットを乱さないように注意してください。

現在、核後上清（PNS）と呼ばれる上清を、新しいFalconチューブに移して保存します。氷上のPNSにおいて、前回と同量のホモゲナイズ緩衝液を用いてペレットを再懸濁し、前回と同様にホモゲナイズおよび遠心分離を行います。2つのPNSサンプルを合わせた後、溶液を複数のマイクロ遠心チューブに分注します。

マイクロ遠心チューブは、使用時まで-80°Cで保存してください。このタンパク質調製物は-80°Cで安定していますが、徐々に活性が低下します。そのため、調製から6か月以内に使用することが推奨されます。

PNSの少量を分注して保存し、ビウレット法によってタンパク質の収量および濃度を決定します。次に、平均総重量約570 mgであるマウス下垂体300個から得られた試料を用い、ゲル電気泳動によってタンパク質の品質を決定します。下垂体タンパク質の収量は60 mg、あるいは組織10 mgあたり1 mgのタンパク質となることが予想されます。

タンパク質濃度は通常、1 mLあたり約40 mgです。ここではマウス10匹を免疫する場合の例を示します。各マウスに、1 mgの下垂体タンパク質を含むエマルション100 µLを注射することを計画し、調製中のロス分としてマウス2匹分を追加し、計12 mgのタンパク質エマルションを調製します。

まず、凍結したタンパク質分注液を手で温めて迅速に融解させます。PBSを用いて、タンパク質濃度を20 mg/mLに調整します。次に、12 mgに相当する600 µLの下垂体タンパク質抽出液を2.5 mLのGas Tite Hamiltonシリンジに吸引し、5 mg/mLの加熱死滅させたmycobacterium tuberculosisを含む完全フロイントアジュバント（CFA）を加えて、手で振って再懸濁させます。

次に、600 µLのCFAを別の2.5 mLハミルトンシリンジに吸い取ります。CFAを満たしたシリンジに22ゲージのマイクロ乳化針を取り付け、固定します。プランジャーをゆっくりと押し、針の中をCFAで満たします。

次に、針のもう一方の端を、下垂体タンパク質抽出液を満たしたもう一方のシリンジに取り付け、固定します。シリンジ内に気泡が入らないように注意してください。CFAシリンジのプランジャーをゆっくりと押し、油性成分を下垂体抽出液（水性）に注入し、少量だけが混合されるようにします。

次に、下垂体抽出液用シリンジのプランジャーを押し込み、CFAシリンジ内へ注入します。全量が混合されるまで、この操作を繰り返して徐々に混合量を増やしてください。この白く均一に分散した物質が、水と油のエマルションとなります。

エマルションが形成されたら、往復サイクルを少なくとも500回繰り返します。最終サイクル後、シリンジ内には水とオイルが1:1の割合で混ざったエマルションが保持され、下垂体タンパク質濃度は10 mg/mLとなります。これでエマルションの使用準備が整いました。エマルションの品質を確認するには、水を満たしたビーカーにエマルションを1滴落としてください。正しく調製されていれば、滴は表面で凝集したまま密な状態を維持します。

エマルションの品質が低い場合、広がり、より小さな液滴に分裂します。このエマルションを調製当日にSJLマウスに注射し、実験的自己免疫性下垂体炎を誘導します。このプロトコルの詳細は、付随するJoVEビデオに記載されています。

下垂体を集め、手技に習熟すれば、迅速に氷上で作業することを忘れずに、1時間でタンパク質抽出を行うことができます。このステップの浸漬調製には、約1時間を要します。初期の混合段階では、ゆっくりと忍耐強く作業することを心掛けてください。

この手法は、自己反応性リンパ球が標的器官を認識し浸潤するメカニズムを解明しようとする自己免疫分野の研究者に道を開きました。このビデオを視聴することで、マウス下垂体からタンパク質抽出液を調製する方法と、それをComplete Freund's adjuvant（完全フロイントアジュバント）と混合して免疫原として使用可能なエマルションを調製する方法を十分に理解できるはずです。注射器および不活化乾燥結核菌を含むComplete Freund's adjuvantを取り扱う際は、誤って針を刺すと危険であることに十分注意してください。

したがって、この手順を実施する際は、常にグローブを着用し、針を適切に廃棄してください。