スペクトル的に解決された二光子顕微鏡を用いたGタンパク質共役受容体相互作用の in vivo定量で

本実験の全体的な目的は、タンパク質の化学量論的および構造的な情報を決定することです。生細胞である酵母細胞を用いたすべてのリガンド複合体において、目的のタンパク質がドナーまたはアクセプター蛍光プローブのいずれかに結合して発現するように遺伝子工学的に設計されています。ドナープローブは、レーザーによって直接励起させることが可能です。

アクセプターは、近傍にある励起状態のドナーからのエネルギー転移を通じてのみ励起されますが、細胞にはパルス近赤外レーザーからの光が照射されます。プローブから放射される蛍光は、透過回折格子によって分光成分に分離され、電子増倍CCDアレイの表面に投影されます。これにより、サンプルの各位置において、個々のすべてのリガメントから完全な蛍光スペクトルが得られます。

検出された蛍光のスペクトルプロファイルは、目的タンパク質の特異的な相互作用に依存します。スキャンセルの各画像ピクセルについて、ドナープローブとアクセプタープローブからの個別の放出を決定するためにデータを解析します。各画像ピクセルでエネルギー転移効率を決定し、その後、FRET効率に基づいてピクセルを分類し、ヒストグラムを作成します。

ヒストグラムの解析により、タンパク質や複合体のサイズおよび構造をin vivoで決定することが可能になります。こんにちは、ウィスコンシン大学ミルウォーキー校のRiku研究グループのMichael Stonemanです。Singhです。

私はウィスコンシン州ミルウォーキーにあるRikus研究室の者です。この手法の主な利点は、細胞内の数百に及ぶすべてのリガメント複合体の完全なエミッションプロファイルを、細胞の1回の完全なスキャンで取得できることです。通常、ほとんどの蛍光顕微鏡法では、細胞内のさまざまな関心領域におけるFRET効率を決定するために十分なスペクトル情報を蓄積する必要があり、対象となる細胞を複数回スキャンしなければなりません。

しかし、拡散による生化学反応がこれらの関心領域の分子組成を変化させ、それによって画像スキャンから得られる情報が制限される可能性があります。本手法は、生細胞内におけるタンパク質およびタンパク質相互作用の研究における重要な疑問、例えば、有害なオリゴマーのサイズはどの程度か、タンパク質のライフサイクルのどの段階でオリゴマーが形成されるか、そして細胞機能においてこのタンパク質のオリゴマーがどのような役割を果たすか、といった問いへの回答に寄与します。

分光分解型2光子顕微鏡は、励起ビームの焦点を目的の試料上の複数の位置に走査することで、イメージングセル内のolima複合体に関する分光情報を蓄積します。1対の直交スキャニングミラーを用いて、レーザービームの焦点を試料上の2つの異なる方向に移動させます。スキャニングミラーの動作はコンピュータによって制御され、CCDカメラからの蛍光強度データの抽出と同期しています。ラインスキャンの蛍光強度データから、特定の光波長に対応する蛍光強度の空間マップを再構成することが可能です。

X線蛍光強度の空間マップを正確に再構成し、各マップに対応する実際の波長を算出するためには、フルオレセイン溶液を用いてラインスキャニングプロトコルの校正を行う必要があります。校正手順を開始するには、ドナータグであるGFPの最大励起波長の2倍にあたる800 nmの波長で励起スペクトルを照射します。励起スペクトルを照射させるには、カメラがインターフェースされているコンピュータプログラムを用いて、レーザーキャビティ内にあるプリズムを移動させ、群速度分散を調整してください。その後、CCDチップにコマンドを送信し、CCDチップの温度を到達可能な最低温度まで下げます。

ダークノイズを低減するため、フルオレセイン溶液 10 µL を顕微鏡スライドガラス上にピペットで滴下し、カバーガラスで覆うことで、カバーガラスとスライドガラスの間にサンプルが薄く均一に分散するようにします。次に、カバーガラスの表面に浸油を少量滴下します。ここで、顕微鏡スライドを XYZTranslationステージに固定し、リニアアクチュエータを手動で調整して、スライドとステージを光軸方向に移動させます。対物レンズが浸油に接触するまでスライドを移動させ、カメラをデータ収集のビデオモードに切り替えることで、CCDアレイに入射した光がコンピュータ画面にリアルタイムで表示されるようにします。

CCDアレイで検出される背景ノイズを低減するため、室内の照明をすべて消します。光学軸方向の移動ステージを制御するマイクロメーターをゆっくりと調整し、サンプルをレーザービームの焦点スポットに合わせます。フルオレセインサンプルに焦点が合うと、CCDアレイ上に鋭いラインとして発光が現れます。

CCDアレイからの画素強度の読み出しデータをコンピュータにダウンロードします。ダウンロードした強度値のマトリックスをImageJで開き、蛍光領域にラインを引くことで、CCDアレイ上の位置の関数として画素強度を測定します。ImageJコマンドを使用してください。

プロットプロファイルを用いて、フルオレセイン試料の放出スペクトルを示すプロットを作成します。レーザーの移動を制御するミラーの増分パラメータを調整してください。試料内の隣接するy位置において、蛍光スペクトルのピークがCCDアレイのスペクトル次元に沿って正確に1ピクセル分移動するように、Y方向のフォーカスを合わせます。

これをモニタリングするために、サンプルの2つの異なるY位置におけるフルオレセインのスペクトル強度をダウンロードします。次に、ImageJで強度画像を開き、各蛍光スペクトルのピーク画素位置を特定します。ImageJのカーソルを使用し、CCDのシャッターを開いたまま、レーザーフォーカスをX方向にサンプルの端から端までスキャンしてください。

ラインスキャンのラインに沿った各ボクセルの放出光が、ラインスキャンの終端にあるCCDアレイに入射するようにします。このラインスキャンで得られたCCDアレイからのデータを保存し、その後CCDアレイのピクセルをクリアしてください。レーザーの位置を移動させ、先に決定した量だけY方向にフォーカスを合わせます。

次に、レーザービームをサンプル上のX方向にスキャンします。ここでも、CCDのシャッターを開いたままにしてデータを保存します。単一の生物学的細胞の寸法より約50%広い物理的領域がレーザー光で照射されるまで、このラインスキャン手順を繰り返します。

特定のラインスキャン画像の行番号と波長との関係を用いて画像を再構成し、異なる波長における複数の励起蛍光強度面マップを取得する必要があります。特定の波長の励起蛍光放出画像を得るには、最初のラインスキャンから得られた画像の中で、その波長に対応する行番号を特定します。その後、後続のラインスキャン画像の隣接する行が、蛍光放出画像の次の行に対応します。

その特定の波長について、該当するすべての画像行をスタックし、その波長におけるサンプルのXY蛍光強度空間マップを取得します。得られるすべての他の波長についてもこの手順を繰り返し、サンプルのデータを収集します。まず、形質転換した酵母コロニーが入ったプレートをインキュベーターから取り出します。

形質転換細胞は、少なくとも3つのタイプを用意する必要があります。目的のタンパク質に2種類両方の蛍光プローブをタグ付けして発現している細胞、ドナー蛍光プローブのみをタグ付けしたタンパク質を発現している細胞、およびアクセプター蛍光プローブのみをタグ付けしたタンパク質を発現している細胞です。

100 mM 塩化カリウムを 100 µL、マイクロ遠心チューブに加えます。次に、マイクロピペットチップを使用して、ドナーおよびアクセプター蛍光プローブの両方でタグ付けされたタンパク質を発現している細胞のプレートから、3～5個の酵母コロニーを掻き取り、100 mM 塩化カリウム溶液に接種します。これらの細胞から、細胞懸濁液を 10 µL 分取し、新しい顕微鏡スライドガラス上に滴下します。

ドロップレットをカバーガラスで覆い、カバーガラスの表面にオイルを1滴滴下します。次に、レーザー光路にあるシャッターを手動で閉じ、レーザー光が顕微鏡対物レンズに到達しないように遮断します。顕微鏡スライドをXY、Z変換ステージに固定し、対物レンズが浸液オイルの滴に接触するまで、スライドステージを光軸方向に移動させます。

次に、広視野照明を点灯し、カメラの設定に移動します。データ収集のビデオモードを選択してください。放射光路に透過回折格子が存在するため、サンプルの広視野画像はひどくぼやけて表示されます。

したがって、透過グレーティングの手前の光路に、半値幅の小さいバンドパスフィルターを配置します。カメラ画面上の細胞の像を確認しながら、細胞に焦点が合うまで、光軸方向にステージをゆっくりと移動させます。次に、単一の細胞をレーザービームの焦点位置に合わせるため、ステージをX方向またはY方向に移動させます。

ワイドフィールド照明光源を消灯し、エミッションパスからバンドパスフィルターを取り除きます。CCDアレイで受信する信号を確認しながら、短時間だけレーザービームの遮蔽を解除します。レーザービームが細胞に入射している間にCCDアレイで蛍光信号が検出された場合は、その細胞の完全な蛍光データ収集スキャンを実行してください。

先に示した校正手順で決定したスキャンパラメータ、特にライン数とY方向の増分を同一にすることが極めて重要です。ドナータグとアクセプタータグの両方が付着したタンパク質を発現している多数の細胞について、細胞位置の特定および蛍光データの取得プロセスを繰り返します。両方の受容体でタグ付けされたタンパク質を発現している細胞の蛍光画像を十分に蓄積した後、ドナー蛍光プローブのみでタグ付けされたタンパク質を発現している細胞、およびアクセプター蛍光プローブのみでタグ付けされたタンパク質を発現している細胞の両方について、全工程を繰り返します。

最後に、以前に説明した手順を用いてすべてのスキャンを再構成し、各データセットの分光分解されたXY蛍光強度空間マップを取得します。これら3つの図に示されているのは、ステリル・トゥ・アルファ因子受容体を発現する酵母細胞に対して実施した分光分解2光子顕微鏡測定から算出された空間マップです。ドナーおよびアクセプター信号の2次元マップは、細胞の各位置から得られた分光放出プロファイルを解析することで得られました。

蛍光強度はその値に応じて擬似カラーで割り当てられ、スケールが挿入図として示されています。次に、KDAおよびKAD画像を用い、上述した細胞の見かけ上のFRET効率マップから抽出した値を使用して、見かけ上のFRET効率の二次元マップを算出しました。さらに、ヒストグラムプロットを作成しました。細胞の測定されたEAPP値は円で表されています。

赤色の実線は、緑色の実線で示された個々のカルシウム関数の合計を用いて、測定データに最適に適合させた線を表しています。プロトコルの本文で説明されているヒストグラムの解析により、無菌的な2つのα因子受容体全リガンド複合体が、in vivoでRBA形状の四量体をとることが確認されます。この手法を習得し、適切に実施すれば、12時間で完了させることができます。

この実験を行う際は、励起光源の出力を低く抑えることが重要です。単一パルスによってドナーが複数回励起されることを避ける必要があります。