定量シナプス：シナプス数を定量する免疫細胞ベースのアッセイ

神経科学における最も重要な目標の一つは、シナプス形成の初期段階を指示する分子的な手がかりを理解することです。そのため、シナプス接続の変化を定量化するための客観的なアプローチを開発することが不可欠となっています。さまざまな実験的な調製試料においてシナプス数を定量化するために、培養ニューロンまたは脳組織の凍結切片試料に、選択的なシナプス前および後マーカーで染色を行い、ニューロン間のシナプス接点に標識を付けます。

その後、細胞または組織を蛍光顕微鏡で観察し、2つの免疫組織化学的マーカーに対応する各チャネルについて、8ビット画像を撮影します。画像は、puncta analyzerを備えたImageJ 1.29を用いて解析します。プレシナプスマーカーとポストシナプスマーカーの共局在の程度を決定するために、共局在点を用いて、調製物内に存在するシナプスの数を算出します。

電子顕微鏡などの既存の手法と比較して、本手法の主な利点は、シナプスアッセイによってシナプス数の分析と定量化をはるかに高いスループットで行えることです。本手法の主な意義は、アルツハイマー病、てんかん、自閉症などの臨床疾患の診断および治療に及びます。これらの疾患では、異常なシナプス結合が潜在的な病理の基礎として関与していると考えられています。本手法を利用することで、影響を受けたニューロン同士がシナプスを形成する能力の欠損を減少または改善させる介入方法を特定することが可能です。

この手法は脳の発達を研究するのに有用ですが、細胞間の接点におけるそれぞれの対向面を選択的に標識できるのであれば、関心のある他のモデル生物や器官系における細胞間接点の数の研究や定量化にも適用可能です。P5〜P7のラットから採取し精製したラット網膜神経節細胞を、ポリリジンでコーティングしたガラスカバースリップ上に播種して神経細胞培養を調製します。24ウェルプレート内で、細胞をトランスフェクション前の3〜5日間、37 °Cで培養します。

トランスフェクション後、播種した細胞が十分に成熟し、シナプスが形成されるまで、さらに7〜8日間細胞をインキュベートします。ウェルから培養液を除去し、あらかじめ温めておいた4%パラホルムアルデヒドを各ウェルに500 microliters加え、室温で7分間固定します。固定後、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を3回洗浄します。

ウェル内の細胞を絶対に乾燥させないようにすることが重要です。ウェルからバッファーを除去した後は、速やかに次のバッファーに置換してください。50%正常ヤギ血清と0.2%Triton X 100を含むブロッキングバッファーを調製します。

各ウェルからPBSを除去した後、ブロッキングバッファーを200 µLずつ加え、室温で30分間ブロッキングします。ブロッキングバッファーを除去し、PBSで3回洗浄します。選択したシナプス前およびシナプス後抗体ペアを含む、90%抗体バッファーと10% NGS溶液の混合液を用いて、一次抗体の希釈液を調製します。

ここでは、前シナプスマーカーであるウサギ抗synapsin抗体と、後シナプスマーカーであるマウス抗homer抗体を使用します。一次抗体希釈液をベンチトップ遠心機を用いて最大速度で5分間遠心し、沈殿した抗体を除去した後、各ウェルに一次抗体溶液を200 µLずつ加えます。一次抗体溶液の乾燥を防ぐため、プレートを加湿容器に入れます。

一次抗体によるインキュベーション後、4°Cで一晩インキュベートします。各ウェルを3回洗浄します。10% NGSを含む抗体バッファーで1:1000に希釈して調製した、適切な二次抗体 200 µLをPBSとともに添加します。

前と同様に、二次抗体でのインキュベーション後、ディッシュを加湿チャンバーに入れ、室温・暗所で2時間インキュベートします。各ウェルをPBSで3〜4回洗浄します。ガラススライド上に、DPI含有Vector Shield封入剤を1滴滴下します。

次に、細胞が付着したカバーガラスを滴上に反転させて載せ、封入します。最後に、カバースリップの周囲を透明なマニキュアで封止します。この際、カバースリップを押し出したり動かしたりしないよう注意してください。

これにより細胞が剥離するため、スライドを乾燥した暗所で少なくとも30分間乾燥させます。ここでは、適切なフィルターセットと63倍のオイル浸漬対物レンズを備えたZEISS Axio Imager蛍光顕微鏡を用いてイメージングを行います。非導入細胞を含むスライドを顕微鏡ステージ上に設置してください。

細胞核を可視化するためにDPIフィルターセットを用い、最も近い隣接細胞から少なくとも細胞2個分以上の距離がある細胞を選択します。この工程でDPIを使用することで、バイアスを避け、細胞選択のランダム性を確保できます。選択した各細胞について、適切なフィルターセット（この場合はGFPおよびTexas Red）を用いて8ビット画像を取得します。

重ね合わせられた擬似カラー画像では、シナプス前マーカーが赤色に、シナプス後マーカーが緑色にそれぞれ示されているはずです。次に、形質転換細胞を含むスライドを顕微鏡ステージに設置します。ここでは、細胞にTD tomato発現ベクターを形質転換させています。

前と同様に、このマーカーを使用して細胞を選択します。選択した各細胞について、今回の適切なフィルターセット（GFP、Texas Red、およびSci five）を用いて、8枚のピット画像を取得します。重ね合わせられた擬似カラー画像では、ポストシナプスマーカーが赤、緑、青で示される必要があります。

ここでは、共局在するシナプスパンクチャを定量化するために、パンクチャ解析プログラムを使用します。Puncta analyzerプラグインはBarry Walkによって作成されたもので、ImageJ 1.26にてリクエストに応じて提供されています。収集した画像の一枚を開きます。

円形選択ツールを使用して、目的のSORの周囲に半径約1細胞径の領域を選択します。関心領域を選択した状態で、プラグインメニューに移動し、表示された解析オプションウィンドウで puncture analyzer を選択します。Red Channel および Green Channel を選択してください。最初に背景減算を行い、結果ファイルを設定します。

「OK」をクリックします。次に、結果を保存する場所を指定します。表示されたウィンドウから、これらの結果をExcelにエクスポートしてさらに分析することが可能です。

次に、ローリングボール半径（rolling ball radius）に 50 が選択されていることを確認し、「white background」オプションのチェックを外します。この修正は必須ではありませんが、本アプリケーションのユーザーに好まれることが多い設定です。視覚的に分かりやすくするため、「OK」をクリックします。

レッドチャンネルの画像に対応するマスクとともに、新しいウィンドウが表示されます。個々の穿刺箇所をできるだけ多く、適切に抽出できるように閾値を調整してください。ノイズを導入しすぎないように注意して、「done」をクリックします。

最小パンクチュエーションサイズを4ピクセルに設定してください。それ以外の箇所は変更しないでください。「OK」をクリックします。

同様の手順を、今回はグリーンチャンネルに対して繰り返します。グリーンチャンネルでの操作を繰り返すと、プラグインにより各チャンネル個別の点状構造（puncta）および2つのチャンネル間で共局在する点状構造の定量化結果が提供されます。ここで示したシナプスアッセイは、脳の凍結切片や、脊髄や網膜などの他のあらゆる神経系組織に適用可能です。

適切なシナプス前およびシナプス後マーカーのペアがあることを前提とします。まず、放血およびPBSでの灌流により安楽死させたマウスから脳組織を採取します。脳全体を4%パラフォルムアルデヒド含有PBSに入れ、4°Cで一晩固定し、翌日に取り出します。

脳をPBSで3回洗浄します。PBSで調製した30% sucroseに浸し、脳を凍結保護します。

組織は最初、浮遊した状態で4°Cに保持し、組織が底に沈むまで待ちます。この段階で凍結保護が完了します。次に、20% sucroseとOCT、およびPBSを2:1の割合で混合した溶液を用い、切片作成に適した方向で脳を包埋します。

例えば、矢状面または冠状面などが挙げられます。次に、ドライアイスを入れたバケツの上に平らな金属板を置きます。そこに包埋した脳を置いて凍結させます。完全に凍結した後、脳をフリーザーバッグに移し、切片作成まで最大1年間、-80 °Cで保存します。

クライオスタットを用いて組織を12〜16 µmの厚さに切り出し、ガラススライドに貼付します。次に、スライドを37 °Cのオーブンに入れて乾燥させます。その後、PBSで3回洗浄し、残留OCTを除去します。

パラフィンペンを用いてスライド上に疎水性バリアを作成し、パラフィンの縁によって液が流出しないようにしてブロッキングバッファーを添加します。スライドを室温で1時間、PBSに含まれる20%正常ヤギ血清に浸し、ブロッキングを行います。次に、0.3% Tritonおよび10%正常ヤギ血清を含むPBSで希釈した一次抗体液に切片を浸します。

ここでは、グルタミン酸作動性シナプス後膜領域の標識にウサギ抗PSD 95抗体を、グルタミン酸作動性シナプス前終末の標識にモルモット抗vGlu2抗体を使用します。スライドを4 °Cに置き、36～60時間インキュベートします。インキュベーション後、スライドをPBSに15分間ずつ3回浸し、一次抗体を洗浄して除去します。

このステップの後、スライドを直射光から遮断して保護してください。0.3% Tritonおよび10%正常ヤギ血清を含むPBSで1:200に希釈した二次抗体を適用します。ここでは、ヤギ抗ギニアピッグ抗体を使用します。

Alexa 488およびgoat anti rabbit Alexa 594を使用します。室温の暗所で2時間インキュベートします。

スライドをPBSに15分ずつ4回浸して洗浄し、封入準備をします。Vector Shield封入剤を少量滴下し、カバーガラスでスライドを覆います。カバーガラスが動かないよう、ネイルポリッシュで固定します。

組織切片のイメージングは、適切なレーザーを備えた共焦点顕微鏡を用い、各切片画像に63倍のオイル浸漬対物レンズを使用して、合計5 µmの深さにわたって0.33 µm間隔で、計15枚の連続光学的切片を撮影して行う。各個体から少なくとも3枚の切片をイメージングし、特定の実験条件につき少なくとも3匹の個体を含める必要がある。連続する3枚の切片のグループから最大強度投影（maximum intensity projections）を作成し、それぞれが1 µmの深さを表す5枚の投影画像を得る。

これらは、アストロサイトが存在しない場合に形成されるシナプスの数を決定するため、RG Csで説明された方法に基づき、ROIを修正してImage Jを用いて定量化しました。免疫化学染色は、基礎成長培地で処理した解離RG Cに対して、期待通りに赤色で示したbassoonに対する抗体および緑色で示したhomerに対する抗体を用いて行われました。シナプス共局在の地点は極めて少なく観察され、in vitroで形成されるシナプス数に対するアストロサイト分泌分子の影響を決定するため、解離RG Csをマウスアストロサイト馴化培地で3日ごとに、合計12日間処理し、その後に染色を行いました。

このニューロンには多数のシナプスが認められましたが、soonが赤色で示されています。Homerは緑色で示されています。細胞質Lee発現TD tomatoをトランスフェクションした解離RDCを基底増殖培地のみで処理した場合、シナプスは見られません。

TD tomatoは青色で、シナプスは赤色で示されています。緑色で示されたポストシナプスマーカーのhomerのシグナルはほとんど見られません。同じ細胞をラットアストロサイト条件培地で慢性的に処理すると、多くのシナプスが観察されます。

ここでは、TD tomatoが青色、synapsinが赤色、homerが緑色で示されています。アストロサイト馴化培地で処理され、赤色のプレシナプスマーカーと緑色のポストシナプスhomerマーカーで染色された精製RGCが示されています。Puncta analyzerを用いて生成されたしきい値マスクは、存在する2つのチャンネルに対応しています。共局在点を確認すると、Puncta analyzerがこれらの点のグラフィカルな表現を出力します。

puncta analyzerにより、両チャンネルで識別された個別のpuncta数および共局在点の数を示す数値出力が提供されます。このニューロンの解析によって得られたデータは、アストロサイトから分泌される分子がシナプス形成を促進する能力を例示しています。ここではシナプスアッセイとして、シナプス前および後における免疫組織化学的染色の共局在を定量化し、重要なアストロサイト分泌シナプス形成分子であるthrombospondinのニューロン受容体を過剰発現させることで、アストロサイト誘発性のシナプス形成が増強されることを示しています。この図に示されているのは、基底成長培地（gm）またはアストロサイト条件培地で慢性的に処理したニューロン1個あたりの平均シナプス数です。

空ベクトルを過剰発現させた細胞と比較して、トロンボスポン受容体を過剰発現させた網膜神経節細胞では、A-C-M-A-C-Mがより強力にシナプス形成を促進します。マウス上丘におけるシナプス密度を定量化するため、コンパートメント特異的な免疫組織化学マーカーを用いて、シナ前およびシナ後コンパートメントを個別に標識しました。ここに示すように、生後7日からP 14にかけて、シナプス数が増加しました。

これは、この発生期間における上丘のシナプス数の増加を示しています。このプロトコルを習得すれば、解離ニューロン培養の場合は約2日で、本手順に従って動物から採取した脳切片の場合は約5日で完了できます。シナプス数の変化が、機能的シナプスおよび超微形態的に正常なシナプスの両方の変化を反映していることをそれぞれ検証するために、電気生理学や電子顕微鏡法などの他の手法が用いられます。

このビデオを視聴することで、シナプス数を定量化するために免疫組織化学を実験準備に適用する方法について十分に理解できるはずです。本プロトコルでは、コンパートメント特異的抗体を用いて、シナプス前および後コンパートメントを選択的に標識する方法を詳しく説明します。ここでは、これらの各マーカーから得られたシグナルの共局在点をシナプスとして定義します。