ミツバチのテングザルの拡張レスポンスの古典的条件における行動薬理学（セイヨウミツバチ）

本手順の総合的な目的は、学習および記憶形成の根底にある分子メカニズムを研究することです。ミツバチにおいて、最初のステップは巣から自由に飛び回っているハチを採集することです。次に、ハチをプラスチックチューブに固定します。

本手順の第3段階は、古典的条件付けを行うことです。学習および記憶形成への影響を調べるため、条件付け前後の特定の時点で薬物を注入することがあります。手順の最終段階は、記憶の保持をテストすることです。

最終的に、薬物投与後の行動の変化により、ミツバチにおける学習および記憶形成の根底にある分子メカニズムを明らかにできる可能性があります。この手法は、記憶形成の分子メカニズムを解明することで、記憶研究分野における重要な疑問への回答に寄与します。

一般的に、この手法に不慣れな研究者は、条件付けおよび記憶想起における刺激提示のタイミングを正確に制御する必要があるため、困難に直面します。また、給餌法も極めて重要です。本手順は、私の研究室の大学院生であるcutting gearingおよびJohannes fabergによって実演されます。実験の前日、UV透過性プレキシガラス製ピラミッドを用いて、午後2時から4時の間に蜂を採集してください。

ラボに戻ったら、ピラミッドを底辺で立て、頂上部のみを露出させた状態で、壁面をタオルで遮光します。頂上部を開き、開口部の上のガラスバイアルにハチが1匹ずつ入るようにして、その後すぐに閉じます。秋および冬において、すべてのハチをガラスバイアルに移し替えるまで、この手順を繰り返します。

ミツバチが屋外を飛んでいないときは、温室内のネットで蜂群を管理し、個別のミツバチをネットから直接捕獲します。1匹につき1本のガラスバイアルを使用し、バイアルを氷上で2分30秒から3分30秒間冷却してミツバチを不動化させます。ミツバチの状態を注意深く観察し、動きが止まったらすぐに氷から取り出してください。

固定したミツバチを、粘着テープを用いて小さなプラスチックチューブに固定します。ミツバチが腹部を自由に動かせるようにし、頭部、胸部、脚は動かないように固定してください。また、首を圧迫しないようにすることが重要です。

ミツバチの準備が完了したら、取り扱いと識別の便宜を図るため、チューブをラックの番号付きボアホールに挿入します。

チューブは常に同じ巣穴に戻します。処理後、コンディショニング場所とは異なる場所で、午後4時から6時の間にミツバチに給餌します。ミツバチの体に触れ、触角を刺激することで、口吻伸展反応（PER）を誘発させます。

ショ糖溶液を用いて、ミツバチに約4 µLのSRA溶液を1滴摂取させます。その際、ミツバチの触角や口器、またはプラスチックチューブを汚さないように注意してください。ミツバチが摂取しなくなるまで、それぞれに給餌します。

触角が溶液に触れた際に、迅速かつ確実な確率的反応（PER）を示すことを確認します。実験の以降の夜は、各ミツバチに1滴のショ糖溶液を4回与えます。高さ約0.5～1 cmのプラスチック製ボウルに水道水を満たします。

リサプレートをプラットフォームとして使用し、固定したミツバチが入ったラックをボウルに入れます。ボウルを段ボールで覆い、室温で一晩保存します。採集翌日の午前10時頃に、ミツバチに嗅覚条件付けを行います。

実験開始の30分前に、ハーネスを装着したミツバチが入ったラックを条件付けサイトの近くに配置します。ただし、ミツバチを訓練する排気管の開口部からは離して置いてください。次に、フード内で条件刺激を調製します。

フィルターチップを用いて、4 µLのクローブオイルを丸いフィルターペーパーにピペッティングします。香り付けしたフィルターペーパーを20 mLシリンジに入れ、プランジャーを挿入します。実験者に音信号を送るためのオーディオプレーヤーを設定します。

これにより、刺激の提示開始、提示終了、持続時間、および配置のタイミングを正確に制御できます。条件付けの間、ミツバチの行動を記録する準備をしてください。条件刺激の開始から無条件刺激の提示までの間に、ミツバチがSSISを伸展させた場合に陽性スコアを与えます。

開いた大顎の間の仮想線を横切ること。獲得試行を開始するには、訓練するミツバチを選択し、排気口の前に10秒間配置します。この10秒間のインターバルの終了直前に、臭気を含むシリンジをミツバチの触角から3 cm離して配置します。シリンジから20 mLの空気を送り出すことで、5秒間にわたって臭気を提示します。

3秒後、湿らせた爪楊枝を用いてショ糖溶液で両方の触角の遠位鞭毛の腹側部分に触れ、無条件刺激を与えます。ミツバチ本体や触角に溶液が付着しないよう注意しながら、ミツバチに爪楊枝を舐めさせます。この複合刺激を4秒間継続した後、ミツバチを訓練環境から取り出し、ラックに戻します。

条件刺激の提示から13秒後までを含め、1回のトレーニング試行は28秒間続きます。試行間隔を10分空けてから、ミツバチをトレーニング場所に連れ戻します。前述の手順に従って3回中の2回目の試行を行い、さらに10分待機してから最後のペアリングを実施します。

その日の訓練が終了したら、ラックをボウルに戻します。午後4時から6時の間に、各ミツバチに4 µLのショ糖溶液を1滴ずつ、計4回投与することを忘れないでください。前述のように、保持テストは訓練後、数分から数日の任意の感覚で実施可能です。記憶テストの準備として、ミツバチのラックを条件付け部位の近くに30分間置きます。

蜂を排気口の前に10秒間置いてテストを開始します。条件刺激を5秒間提示し、PERの発生を確認します。その日のテストが完了した後、ラックをボウルに戻します。

以前に実演した通り、午後4時から6時の間に、1匹のミツバチに4 µLのショ糖溶液を4回与えてください。全実験の最後に、SRA溶液で触角に触れ、ミツバチが依然として口吻を伸ばせていることを確認し、解析対象に含めます。ミツバチは全実験を通じて生存し、PERが完全な状態で保持されている必要があります。一部の研究では、嗅覚記憶に対する薬理学的介入の効果を調べるために、全身投与が用いられます。これらの投与は、実験デザインに応じて異なるタイミングで行われます。

まず、使い捨て皮下注射針を用いて、飛翔筋の上方にあるS scootle裂付近のS scootin後部の角皮に小さな穴を開けます。次に、ガラス毛細管にテストする溶液を1 µL満たします。毛細管を角皮の穴に挿入し、溶液を飛翔筋に注入します。

熟練した実験者は30秒に1回Bを注入することができ、これにより注入と条件付けの正確なタイミング制御が可能になります。ここでは2つの実験を提示します。最初の実験では、トレーニング前に生理食塩水を全身投与したことが記憶の学習に及ぼす影響を検討します。

本研究では、無処置のAグループ、1 µLのリン酸緩衝生理食塩水を全身投与したグループ、またはシャムグループの3つのグループを設定しました。これらの処置は、左側に示すトレーニングの30分前に行われました。獲得段階において条件反応を示した動物の割合は、3回のトレーニング回数を経て増加しましたが、グループ間に差は認められませんでした。

右側の棒グラフは、PBSの注入および擬似病変のいずれも記憶保持に影響を与えなかったことを示しています。2回目の実験では、トレーニングの24時間後に、トレーニングから40分後に注入を行いました。ミツバチを、生理食塩水を投与するグループと、タンパク質合成阻害剤であるアニサイクリンを1 µL投与するグループの2つのグループに分けました。右側の棒グラフは、アニサイクリンを投与されたミツバチにおいて記憶保持が明らかに低下したことを示しています。これらの結果は、嗅覚記憶の形成におけるタンパク質合成の重要性を強調するものです。

本手順に従い、電気生理学的記録を行うことで、発達後の学習および記憶形成の神経生理学的基盤は何かといった追加の疑問を解消することができます。この手法は、学習および記憶研究の分野において、ミツバチの記憶形成における分子および神経生理学的メカニズムを探索する研究者に道を開きました。