好気性菌による制御植物組織の分解のための寒天ブロックの小宇宙

本手順の全体的な目的は、木材の含水率および外来基質を厳密に制御したペトリ皿マイクロコスムに、好気性木材腐朽菌を接種することです。まず、既知の培地を正確な量で用いてマイクロコスムを調製します。次に、分解させる木材および外来の固体基質を、基質同士が接触しないように、寒天表面のプラスチックグリッドの上に配置します。

次に、マイクロコスムに試験菌を接種して培養します。培養後、質量減少を測定し、分析用の組織を調製するために木材ブロックを回収します。最終的に、質量減少の測定、菌糸形態の観察、および誘導結合プラズマ分光法などの標的元素分析を通じて、木材の生分解の程度や外来元素源の役割を示す結果を得ることができます。

こんにちは。ミネソタ大学バイオプロダクト・バイオシステム工学科のJonathan Schilling博士の研究室に所属しているBrooke Jacobsonです。本日は、好気性菌類による植物組織分解の微小環境としてペトリ皿を利用する手順をご紹介します。私たちの研究室では、菌類によるリグノセルロース分解のメカニズムを研究するためにこの手法を用いています。

リグノセルロースは、リグニン、セルロース、およびヘミセルロースで構成される植物組織です。我々が最も頻繁に研究する組織は木材であり、オーガーブロック設計の非専門的な側面におけるミスが、失敗の最も一般的な原因となり、研究間のばらつきの主な要因となります。そのため、我々のオーガーブロックのセットアップをビデオで公開することは有用です。経験から、この手順によって高品質でばらつきの少ない結果が得られることが分かっています。

それでは始めましょう。これらの実験では、マイクロコスム内のウッドブロック上のヘッドスペースを広げるため、一般的なペトリ皿よりも深さが1cm深いペトリ皿を使用してください。

カルシウムおよび鉄を含まない培地を、シャーレ1枚あたり20 milliliters分だけ調製して、マイクロコスムの準備を開始します。サプリメントを添加した約400 millilitersの脱イオン水を含む500 milliliterメスフラスコに、15 gramsのアガロースを加えます。あらかじめ調製したストック溶液を使用して、混合物に微量栄養素を添加します。

栄養素を加えた後、メスフラスコを500 milliliterの標線まで満たします。次に、培地を1000 milliliterのフラスコに移します。121 degrees Celsius、16 PSIで20分間オートクレーブ滅菌します。

テストプレートを投与する前にアガーが凝固するのを防ぐため、フラスコ1本あたりの容量が500 millilitersを超えないように注意してください。オートクレーブ後、結露を最小限に抑えるため、培地が手で触れて冷たくなるまで冷却させます。これらの実験では、水分量またはmcなどの水分含有量を最小限に抑えることが極めて重要です。

80%を超えると組織に無酸素状態が引き起こされます。好気性真菌による分解を制限し、一度変動性を高めます。冷却してください。ポータブルピペットエイドと10 milliliterの滅菌ポリスチレンピペットを使用して、無菌的に操作します。

バイオセーフティキャビネット内で、寒天を高く積み上げたプレートに分注します。次に、プレートの底に合うようにプラスチックメッシュグリッドを十分に切り出します。グリッドを切り出し、石鹸と水で十分に洗浄した後、本デモンストレーションのためにメッシュグリッドを乾燥およびオートクレーブにかけられるよう準備します。

重要な材木資源である南部黄松（SYP）を使用します。米国における住宅用住宅で使用されている未処理の材木を用い、木目に沿って縦方向に1回切り出し、節のない19 by 19 mmのブロックを作成します。この長さをさらに切り分け、19 mmの立方体ブロックにします。

鋸ではなくノミと金槌を使用し、19 mm³のブロックを木目に沿って半分に割ります。これにより、アグリブロック・マイクロコスム内のプラスチックメッシュに接する一面が粗いエッジとなり、ラベルを貼るための上面が滑らかなエッジとなります。ブロックの滑らかなエッジに鉛筆でラベルを付け、各処理群に必要な数に加え、汚染モニターおよびオーブン乾燥試料として並行して調整するベースラインデータサンプルとなる非接種コントロールの分までブロックを切断します。サンプルをアルミニウム製ホエイパンに入れ、対流式オーブンを用いて100 °Cで48時間乾燥させます。

サンプルをオーブンからデシケーターに移し、冷却します。サンプルをあらかじめ計量し、初期のオーブン乾燥重量を決定します。最後に、プラスチックグリッドや木材を含むサンプルを、濡れるのを最小限に抑えるためにアルミホイルでしっかりと包み、オートクレーブの準備をします。

各サンプルを個別に包む必要はありませんが、蒸気への曝露が少なく、かつ均一である必要があります。ラベルを貼ったサンプルを121 °C、16 PSIで1時間オートクレーブします。滅菌済みのバイオセーフティキャビネット内で、空のAE、接種用メッシュ植物基質外来物質用のソースプレート、シャーピー、パラフィルムストリップ、ピンセット、および移送ツールを準備します。

接種の次のステップは、汚染リスクを最小限に抑えるため、材料をシャーレ（ペトリ皿）に加えることです。転移ツールとピンセットは、使用するたびに95% ethanolで火炎滅菌してください。まず、シャーレにプラスチックメッシュを加えます。

次に、ここに木質基質を加えます。初期収穫時と後期収穫時のデータをペアリングできるように、メッシュの長手方向に沿って2つの木材ブロックを配置します。これらのブロックは、木目に沿って、かつ菌接種源の方向を向くように並べて配置します。

次に、外来材料を添加します。ここでは、糸状菌による腐朽に対する石膏の役割を検証しています。したがって、菌が木材に到達する前に、これらの石膏ディスクに接触するようにする必要があります。

メッシュの上にある各ブロックと接種点の間に、石膏ディスクを1枚ずつ配置します。ディスク同士を近づけて配置しつつ、木材内部でディスクが接触しないように注意してください。菌の接種源には、20 mLの寒天培地で2週間培養したものを用い、直径7 mmの4番コルクボーラーでプラグを作成して使用します。

これにより、接種量を制御することができます。未接種のコントロールについては、滅菌プレートからプラグを追加するのが最適です。接種物と外来基質または材との接触を避け、それらを近接して配置してください。

1ブロックにつき、接種プラグを1つ使用します。カミソリでカットしたパラフィルムでシャーレを密封します。プレートを水平に保持し、パラフィルムを滑らかに連続的な動作で巻き付けてください。最後に、アルコール耐性マーカーを使用してシャーレの蓋にラベルを貼り、それぞれの基質の上に直接ブロック番号を記入します。

また、石膏ディスクの上に円を描きます。内容物の揺れを防ぎ、温度変動による結露を最小限に抑えるため、プレートを慎重に生物学的インキュベーターへ移します。ここでの条件は20 °Cの暗所とし、最後の回収を除いて、時系列の回収を無菌的に行います。

5週目の採取時点で、処理ロット全体を取り出します。各プレートの底面と上面に70% ethanolをスプレーし、バイオセーフティキャビネット内で火炎滅菌したピンセットを使用して材料を取り除きます。農業用プレートを廃棄する前に、形態Fまたはメロンに焦点を当てて写真を撮影してください。

次に、処理するブロックを取り出します。余分なphaを転がして取り除きますが、分解した物質を失わないよう注意してください。アルミパンでブロックを乾燥させ、コントロールの新鮮重量と乾燥重量を用いて質量減少量を算出し、過剰な吸い出し（wicking）が起きていないか確認します。

質量減少データは分解の進行度を測定するのに役立ち、重要なデータとなります。元素濃度をグラム重量ベースで算出する場合、パーセンテージデータを正規化する必要があります。統計処理のため、明らかに水浸しとなっている濃褐色のブロックにはラベルを付け、追跡してください。

最後に、オートクレーブ対応バッグに入れて培養物を滅菌廃棄し、プラスチック製サポートメッシュや、今後の実験に再利用可能なその他の構成部品を回収します。アグリブロック・マイクロコスムのセットアップでは、アグリコンタクトからブロックを高くするために、パイン材のブロックをプラスチックメッシュの上に配置しています。Circular Crainsは、石膏表面に直接接触して、および木製ブロックの中へと成長しました。

この菌糸体は、木材と外因性の栄養元素源との間の重要な接点を表しています。寒天または固体材料におけるこれらの外因性物質源を制御できることは、土壌ブロック設計に対するアグリブロック設計の主な利点です。ここでは、アグリブロックマイクロコスムでパイン材を用いて5週間および15週間培養した後の、ser crainによる木材腐朽度の指標としての平均重量減少率を示しています。

処理は行わなかった。5 mMの塩化カルシウムを、純度99%以上の石膏または1%の鉄を添加した石膏を含むアガーに加えた。各収穫において、同じ文字が付されたバー間に有意差は認められなかった。エラーバーは標準偏差を示しており、対照区の褐色腐朽したパイン材ブロックでは60%以上の重量減少が観察された。これは、米国試験材料協会の標準目標である50%以上の腐朽を満たしている。

16週目における腐敗の平均変動係数は0.055でした。変動が小さかったことに加え、処理効果も認められました。塩化カルシウムとして、あるいは純粋な石膏として寒天に添加したことで、菌類による腐敗が抑制されました。

興味深いことに、石膏に鉄を添加すると分解速度が回復しました。分解15週目の5つの反復試料を観察した結果、カルシウムではなく鉄が重要であることが示唆されました。同様の褐色腐朽試験菌において、円形ラミナの菌糸の色がmeinを示しています。

処理間での外菌糸の違いを確認するため、ブロックを除去して乾燥させました。その結果、カルシウム欠乏処理では菌糸が欠如していることが明らかになりました。また、純カルシウム処理では黄変が見られ、鉄添加処理では錆のような外観を呈していました。

コントロールは、比較用の非接種ブロックを表しています。興味深いことに、高鉄分培地を使用すると主効果が消失します。総合すると、この菌類はカルシウムではなく鉄を利用していることが示唆されます。

本資料では、オーガーブロックセットアップを用いて、好気性糸状菌による植物組織の生分解試験を成功させる方法を解説しました。この手順を行う際は、基質同士、特に植物組織とオーガーが接触しないようにすることが重要です。また、オーガーとプレートレットからの水分含有量を最小限に抑え、培養前に各プレートの内容物が移動していないか再確認してください。これらの変数を考慮することで、土壌ブロックセットアップを使用する場合よりも、分解環境をより適切に制御することが可能になります。

これにより、研究上の疑問に答えるために必要な統計学的検出力を備えたデータを生成することができます。以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。