発現とHEK - 293T細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録用に最適化されたトランスフェクション戦略

電位依存性イオンチャネルを組み換え発現させた培養ヒト胚性腎細胞の活性を研究するには、一般的に電気生理学的な手法が用いられます。正常に記録を行うには、細胞膜上に検出可能なレベルでチャネルが十分に発現していること、および個々の細胞を単離できる十分に低い細胞密度で播種されていることが必要です。しかし、このような発現には通常28 °Cでの長時間のインキュベーションが必要であり、その過程で細胞の接着性や膜の安定性が低下することが多く、細胞記録の妨げとなっています。

ここでは、これらの問題を回避するために最適化された細胞培養およびトランスフェクションの手法を実演します。細胞を適度なコンフルエンシーでトランスフェクションし、十分なイオンチャネル発現が得られるまで28 °Cでインキュベートします。その後、トランスフェクションした細胞を低密度でガラスカバースリップ上に播種し、細胞の接着と膜の安定化を促すため、37 °Cで数時間インキュベートします。

適切に播種された細胞を、EGFPの共発現およびホールセルパッチクランプ法によって同定します。そのまま記録を行うか、あるいは細胞を再度28 °Cでインキュベートします。チャネルの細胞表面への発現をさらに高めるため、L CAV 1、L CAV 2、または L cav 3 などの電位依存性カルシウムチャネルを導入した細胞で記録実験を行った結果、これらのチャネルが細胞に正常に導入され、発現していることが示されました。

ここではL CAV 3の代表的な結果のみを示していますが、当研究室では、ヒト細胞株におけるパッチクランプ記録のために、発現効率の低いイオンチャネル遺伝子の発現を高める手法を開発しました。従来のアプローチでは、まずカバースリップ上に細胞を播種し、イオンチャネル遺伝子を含むプラスミドcDNAをトランスフェクションし、電気生理学的記録を行う前に、高効率なイオンチャネル発現を実現させるため、28 °Cで数日間インキュベートします。我々の新しいアプローチでは、記録前に行う28 °Cでの必要インキュベーション時間を大幅に短縮できます。

次に、28°Cでのインキュベーション時間を短縮することで、細胞膜の安定性が大幅に向上し、トランスフェクション後の細胞のカバーガラスへの接着性が向上することがわかりました。これにより、記録可能な細胞数が増加し、実験効率が著しく向上します。トランスフェクションの前に、完全にコンフルエントになったHEK 2 9 3 T細胞のフラスコを1:4に分割して新しい25 cm²フラスコに移し、細胞を37°C、5% CO2インキュベーター内に配置します。

細胞を3〜4時間静置して接着させます。4時間後、微分干渉顕微鏡（DIC）で細胞を観察し、接着を確認します。細胞が丸い形状ではなくなり、扁平化していることに注意してください。突起または偽足が観察されます。

細胞のコンフルエンスが低い場合は、見た目は同じですが、細胞間の間隔がより広くなります。細胞の接着後、必要な試薬を混合し、標準的なリン酸カルシウム法によるトランスフェクションを行います。1つのフラスコあたり、トランスフェクション溶液600 µLに計12 µgのDNAを調製してください。

ここでは、さまざまなイオンチャネルのCDNAsをP-I-R-E-S two EGFPプラスミドにクローニングしています。この発現ベクターを哺乳類細胞株にトランスフェクションすると、クローン挿入されたインサートと同じmRNAから、強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）が産生されます。これは、イオンチャネルのコーディング配列の直下かつEGFPコーディング配列の上流にある内部リボソーム進入部位（IRES）から翻訳が開始されるためです。これにより、EGFPタンパク質を目的のタンパク質に直接融合させた場合に起こりうるタンパク質機能への干渉を避けつつ、トランスフェクションされた陽性細胞を同定することが可能になります。

トランスフェクション溶液を細胞の上に滴下し、その後、フラスコを静かに揺らし、37 °Cのインキュベーター内で一晩静置します。翌日、蛍光顕微鏡で細胞を観察し、トランスフェクション効率を確認します。正しくトランスフェクションされた細胞は、細胞全体が緑色に光って見えます。

トランスフェクションが確認されたら、温めた培地を4〜5 mL、慎重に倒置フラスコにピペットで分注します。フラスコをゆっくりと反転させて細胞表面を下にし、フラスコを揺らして洗浄液が細胞上を穏やかに流れるようにして、細胞を洗浄します。培地を除去し、この洗浄操作を繰り返します。

さらに2回ステップを行う。その後、フラスコに6 mLの培地を加え、37 °Cで2時間インキュベートする。無脊椎動物のイオンチャネルの発現には、いくつかの課題がある。

まず、これらはサイズが大きく、そのため小胞体での翻訳に時間を要する場合があることが挙げられます。また、哺乳類細胞株において細胞膜への標的化が効率的に行われない可能性もあります。さらに、種によってコドン使用頻度が異なるため、HEK 293Tなどの哺乳類細胞では一般的ではないコドンが高頻度で含まれる異種由来のcDNAが存在する場合があり、これらの困難を克服する必要があります。

洗浄後のトランスフェクション後に37°Cで2時間インキュベートした後、発現期間を延長させるためにフラスコを28°Cのインキュベーターに2〜6日間移します。インキュベーション時間は、発現させるイオンチャネルの種類ごとに経験的に決定する必要があります。28°Cでの長期間のインキュベーションは、細胞の剥離や膜安定性の低下を招くためです。

電気生理学的研究を実施する前に、さらなる細胞調製が必要です。まず、アスピレーションピペットを用いて、トランスフェクションした細胞から培地を除去し、37 °Cのトリプシン溶液を1 mL、倒置したフラスコ内に加えます。その後、フラスコをゆっくりと細胞表面が下を向く位置に戻し、トリプシンが細胞上を穏やかに流れるようにします。

フラスコを元に戻し、トリプシンを除去します。次に、250 µLの温めたトリプシンを細胞に直接加え、細胞が剥離するまで37 °Cで3〜5分間インキュベートします。その間に、poly L lysineコーティングされたカバーガラスを3〜8枚、60 mmの培養皿に入れ、5 mLの温めた培養液を加えます。

細胞を剥離させた後、ピペッティングを約6回行い、4 mLの温めた培地で再懸濁します。次に、マイクロピペットのチップを用いてカバースリップを押し下げ、ディッシュの底に密着していることを確認します。その後、再懸濁した細胞を250～500 µL添加します。細胞を37 °Cで3時間インキュベートし、カバースリップに接着させます。

細胞を37°Cで長時間放置すると、細胞分裂が起こり、導入されたプラスミドが希釈されてしまいます。導入後の細胞は、ここに示されているように、互いに孤立する十分に低い密度で播種する必要があります。これにより、電気生理学的記録が容易になります。

補助サブユニットを必要とする細胞の場合、電気生理学的記録を行う前に、細胞を28 °Cに移動させてさらに3〜4日間インキュベートする必要があることが多い。補助サブユニットを必要としない細胞については、このインキュベーション後すぐに記録を行うことができる。

ここで使用した電気生理学装置は、アンプ、電動式デュアルピペットマニピュレーター、落射蛍光顕微鏡、および灌流システムで構成されています。装置は防振台の上に設置されており、40インチの高さのタイプ2ファラデーケージによって外部からの電気ノイズを制限しています。電子制御システムには、Digitidata 1440（アナログ-デジタル変換インターフェース）を搭載したPCと、pCLAMP 10.1ソフトウェアを使用しています。

コンピューターモニター増幅器、電動マニピュレーター、およびバルブリンク灌流制御システムはすべてファラデーケージの外部に設置されています。自立型の19インチ金属製電気ラック上のすべての電気機器は、銅製配電盤に接地され、医療用絶縁変圧器に接続されており、これによりライン絶縁、安定した接地、およびサージ抑制が確保されています。ヘッドステージのマイクロピペットホルダーに、抵抗値が2〜5 MΩの火炎研磨済みマイクロピペットを取り付け、実験の準備を行います。

パッチピペットに内部液を満たし、弾いて気泡を除去した後、ヘッドステージに取り付けます。次に、ピンセットを使用して、細胞が播種されたカバースリップ1枚を、室温の外部記録液3 mLが入った35 mmプラスチックペトリ皿に移します。薬剤実験を行う際は、マイクロピペットを用いて既知量の薬剤を皿に添加するため、記録液の容量を正確に測定する必要があります。皿を顕微鏡のステージ上に設置します。

次に、マイクロ電極ホルダーのハーフセルに3 Mの塩化セシウムを満たします。その後、参照電極をハーフセルに挿入し、マイクロマニピュレーターを用いて接地電極をバスに配置し、パッチピペットをバス溶液内に下げます。蛍光モードで細胞を可視化し、単独で存在し、陽性にトランスフェクションされた接着性の緑色細胞を視野の中央に配置します。

バスモードの状態で、パッチピペットを細胞に近づけます。コンピュータ画面に表示されるスクエア波のトレースをゼロに合わせます。パッチピペットの位置を調整し、細胞に軽く接触させ、画面上のスクエア電流トレースが変動し始めるようにします。

ギガオームシールが形成されるまで、接続したシリンジで緩やかに吸引します。ギガオームシールが形成されたら、プログラムをパッチモードに切り替えます。シリンジで短時間強く吸引し、細胞膜を破ります。

次に、セルモードに切り替え、アンプリファイアでホールセルパラメータを使用します。容量性過渡応答を補正するためには、パッチを安定させ、細胞内記録液をパッチを掛けた細胞内に透析させる必要があります。ここに、本実験用に作成されたボルテージクランププロトコルを入力します。

実験者は、細胞膜を横切る電圧を変化させたときに生じる、電位依存性イオンチャネルを介したイオン電流を測定するためのプロトコルを設計しました。ここでは、ソフトウェアで細胞を-110 mVに保持し、その後-70 mVまで250 msの間ステップ状に変化させるIVプロトコルについて検討します。その後、再び-110 mVの保持電位に戻します。各ステップで10 mVずつ増加させ、-70 mV、-60 mVというように段階的に変化させ、最終ステップを+20 mVまで設定します。

アンプのローパスベッセルフィルターを用いて、記録された電流を10 kilohertzでフィルタリングし、clamp X 10.1ソフトウェアを用いてサンプリング周波数2 kilohertzでデジタル化します。漏洩電流が10%未満と最小限に抑えられた記録のみを使用してください。解析のため、HEK 2 93 T細胞を培養し、ここに示す3つのL Cavカルシウムチャネルをトランスフェクションしました。異種イオンチャネルcDNAのトランスフェクションの成功は、P-I-R-E-S two eeg FPベクターから生成される蛍光によって確認しました。

ここでは、無脊椎動物のCav3電位依存性カルシウムチャネルの発現に成功したことを示します。細胞をトランスフェクションしていない場合、カルシウム電流は誘発されません。一方、トランスフェクションされた細胞にホールセル電位クランププロトコルを適用すると、大きな電流が生成されます。

実験者は、必要に応じてさまざまな電気生理学的条件およびデータ解析レジメンを使用することができます。本手順を試みる際は、実験のタイミングについて自身の判断で決定することが重要です。細胞膜での発現効率はチャネルによって異なるため、細胞の生存率を高めるとともに、目的とするチャネルの表面発現を最大化するための最適な戦略を決定することは、実験者の判断に委ねられています。

このビデオを視聴することで、ヒト細胞株の培養および維持方法に加えて、電気生理学的記録のために、異種イオンチャネルのcDNAおよびサブユニットcDNAをこれらの細胞にトランスフェクトする方法について十分に理解していただけたことと思います。