胚様体の凍結切片を使用して、多能性幹細胞の解析

パート1、はじめに。こんにちは、ラファエルです。私はブラジルのリオデジャネイロ連邦大学にあるStevens Hans教授の研究室のポストドクターです。

こんにちは、イスマイルです。私はリサーチアシスタントであり、教授も務めております。このビデオでは、Android bodiesの透過切片の作製方法について解説します。

それでは始めましょう。パート2では、材料と器具について説明します。この手順では、凍結標本用の包埋剤が必要です。

細胞固定用の4%パラホルムアルデヒド溶液、および凍結保護用のスクロース溶液。先端がわずかに曲がった針、EBSをより詳細に観察するための実体顕微鏡、およびシェーカー。パート3。

ここでは、ヒト胚体（embryo bodies）を非 adhere 培養プレートで培養しています。ピペットを用いて、15 mL コニカルチューブに回収するため、すべての胚体をできるだけ密集させます。その後、EBSを注意深く回収し、チューブに移します。

材料の量が少ないため、すべてのebsを回収することが重要です。EBSをデカンテーションした後、培地を慎重に廃棄します。チューブの底にペレットが確認できるはずです。これで、固定の手順に進むことができます。

EBSは、PBSまたはリン酸緩衝生理食塩水中の4%パラホルムアルデヒド溶液で固定します。ペレットをPFA溶液で再懸濁させることが重要です。その後、EBSを固定液で30分間固定します。

固定後、PFA溶液を慎重に取り除きます。EBSを再懸濁させないよう注意しながら、EBSの凍結保護を開始するためにPBSによる10% sucrose溶液に置換し、この溶液中で30分間保持します。次に、10% sucrose溶液を慎重に取り除き、EBSを20% sucrose溶液に再懸濁させます。

再び、EBSをこの溶液中で30分間保持します。最後に、20% sucrose溶液を除去し、PBSで調製した30% sucrose溶液に交換し、さらに30分間保持します。これで、EBSの方向付けおよびブロッキング工程に進むことができます。

当研究室では、空のカプセルシェルを型として使用しています。ebsのブロッキングには、ebsを回収する前にチップの内壁をスクロース溶液でコーティングすることが重要です。これで、慎重にEBSを回収し、それらがチップの底に沈殿するまで待機することができます。

次に、EBSをブロックの中央に配置します。これがブロック内におけるEBSの最終的な位置となります。実体顕微鏡と細いチップを用いて、ショ糖溶液を可能な限り回収し、排出します。

常にebsを回収しないように注意します。先端をわずかに曲げた針を用いて、すべてのEBSをブロックの中央に配置します。最後に、残ったショ糖溶液をフィルターペーパーで吸収して回収します。

高品質な切片を得るためには、ブロック内におけるEBSの正確な位置が非常に重要です。以下は、シェル内でのEBの配置が不適切な例です。EBSを配置し、ショ糖溶液を除去した後、EBSが再懸濁されないよう細心の注意を払いながら、シェルの端からOCTを充填します。

残った気泡をピペットで取り除き、シェルを15分間攪拌します。攪拌後、OCTブロックをドライアイスで凍結させます。

この時点で、ブロックをアルミホイルで包んで−80 °Cで保存し後日解析するか、またはクライオスタットのパート4「切片作成」に進みます。凍結切片を作成するには、使い捨てまたは永続的なブレード、OCT化合物、およびポリL-リシン処理済みのガラススライドが必要です。OCTブロックを冷凍庫から取り出し、−20 °Cに達するまでクライオスタット内に保持します。

次に、ブロックをスタンドに設置し、ブレードのエッジと平行に合わせます。EBサンプルは他の多くの組織サンプルよりも格段に小さいため、材料の損失を最小限に抑えるために、ブロックの全表面が同時にブレードに接触していることを確認することが非常に重要です。設置後、ブロックを10 µmの厚さで薄切し、これらの切片を直接ガラススライド上に回収します。

スライドは、好ましくは-70°Cで保存するか、または当日に使用してください。得られた材料は、免疫組織化学染色または免疫蛍光染色に用いることができます。結論として、本手法で述べた方法は、ヒトH9またはマウスUSP1幹細胞株から分化した胚体の薄いクリオスタット切片を得るための、比較的安価で簡便なプロトコルを提供します。

得られた凍結切片は、タンパク質発現やEB形態を解析するための幅広い手順に使用できます。