高濃縮ニューロン培養の世代のための皮質組織ブロックの凍結保存

こんにちは。私はアランです。カリフォルニア大学アーバイン校の神経生物学・行動科学科にあるHorney Lu博士の研究室に所属しています。そして、私はボブです。本日、Lu博士が、高品質な一次ニューロン培養を後に得ることを見据えた、皮質組織ブロックのルーチンな凍結保存のための、迅速かつ効率的で信頼性の高いプロトコルをご紹介します。

それでは、開始しましょう。洗浄して細切した組織を、10%TMSO凍結保存液を含むクライオバイアルに入れます。

クライオバイアルを凍結容器に入れ、-80 °Cで少なくとも4時間保持します。その後、凍結したクライオバイアルを液体窒素に入れて長期保存します。培養を行う際は、クライオバイアルを温水バスで融解し、温めたHBSSで洗浄して残ったDMSOを除去します。

解離のためにトリプシンと共に新鮮なHBSSを添加し、その後10% EBSを含むDMMを添加します。解離酵素活性を停止させるため、細胞を遠心分離して回収し、ペレットを10% EBSを含む新鮮なDMMで再懸濁して、あらかじめポリリシンでコーティングしたディッシュに播種します。24時間後、DMMを添加剤入りのNeurobasal培地に交換し、10日間培養します。

このプロトコルでは、皮質組織を細切するために鋼製のカミソリブレードを使用します。カミソリは70% ethanolで少なくとも2時間滅菌させる必要があります。10倍濃度のストック溶液を滅菌水で希釈して1x Hank's buffered salt solution (HBSS) を調製し、この1x HBSSは組織処理まで氷上または4°Cで保存します。

凍結保存液の凍結保護剤として、ジメチルスルホキシド（DMSO）が使用されます。本プロトコルでは、1×HBSSにDMSOを容量比で10%の濃度で希釈して使用します。4°Cで保存する前に、完全に混合させてください。サンプルの凍結速度を制御するために、Nalgene製の凍結容器を使用します。

あらかじめラベルを貼った2.5 milliliterのクライオバイアルを凍結コンテナに入れます。凍結コンテナを複数使用する場合は、コンテナ自体にもラベルを貼り、バイアルに corresponding なコンテナ名を記載しておくのが良いでしょう。事前に冷却しておいた10%DMSO、凍結培地、および凍結コンテナを、滅菌済みの生物学的安全キャビネット内に運び込みます。

ここで、1 mLの凍結保存液を各クライオバイアルにゆっくりと加えます。キャップがしっかりと閉まっていることを確認した後、組織処理の直前に、バイアルを入れた凍結容器を4 °Cで少なくとも2時間静置します。あらかじめ滅菌したカミソリの刃を十分に洗浄する必要があります。3分間の洗浄を3回行います。

残ったエタノールを除去するには、滅菌水を使用すれば十分です。カミソリは滅菌水に長時間浸すと酸化しやすいため、この洗浄手順は迅速に行う必要があります。洗浄前に、組織をアイスパックの上に置いてください。

冷たい X-H-B-S-S で軽くすすぎ、浮遊しているデブリを除去します。滅菌済みの針を用いて、組織片に残っている膜や血管を取り除きます。洗浄の際は、組織の構造的完全性が損なわれないよう注意してください。

これにより、洗浄済み組織の切断効率は未処理の組織とは明らかに異なり、大部分の膜や血管が除去されているはずです。組織の洗浄とすすぎが完了したら、切断を開始できます。組織を約1 mm³のサイズのブロック状に、きれいに切り分けることが重要です。

ブロックが大きすぎると、融解時の細胞回収率が低下します。一方で、ブロックが小さすぎる場合の過剰処理も避ける必要があります。細切した組織は、オートピペットを用いて、冷却した1X-H-B-S-Sで回収できます。

回収したすべての組織を回収するため、ディッシュをHBSSで十分に洗浄してください。次に、組織を大量の1X HBSSに加え、底に沈殿させて緩いペレット状にします。これにより、組織がHBSS中で沈降する際に、残存している可能性のあるデブリが洗浄されます。組織を分注する前に、あらかじめ冷却しておいた凍結容器とクライオバイアルを用意してください。

組織の充填プロセスを迅速に行うため、すべてのバイアルのキャップを外しておいてください。室温でのDMSOへの曝露は10分以内に制限する必要があります。すべての組織を使い切るまで、一度に1つの凍結容器ずつ処理することをお勧めします。

緩い組織の組織上清の吸引を開始し、ペレットを乱さないようにして、可能な限りペレットの近くまで吸引します。次に、ピペットに200 µLの広口チップを装着します。より口径の小さいチップを使用すると、組織ブロックペレットの底部に向かうブロックの構造が損なわれるため、使用しないでください。

組織を200 µLずつゆっくりと回収します。この組織をクライオバイアルに加え、すべてのバイアルが満たされるまで次へと進みます。10分ルールが必要になる場合があります。

凍結容器に入れたクライオバイアルを速やかに-80°Cのフリーザーに入れ、少なくとも4時間、または時間に限りがある場合は一晩凍結させます。十分な時間が経過した後、凍結容器をフリーザーから取り出し、速やかにクライオバイアルをクライオボックスに配置します。長期保存のため、クライオボックスを液体窒素保存容器のラックに入れます。

液体窒素からクライオバイアルをできるだけ速やかに取り出し、クライオボックスが室温にさらされる時間を最小限に抑えます。37 °Cのウォーターバスに浸してサンプルを急速に融解させます。その際、キャップが常に水面より上にあるようにしてください。頻繁に確認し、小さな氷の粒子が見えるまで融解させます。

安全キャビネットに入れる前に、クライオバイアルを70%エタノールで滅菌します。組織がクライオバイアルの壁面に付着している場合は、多量の温めた1×HBSSを加えて、解凍した組織を回収してください。HBSSを用いて、緩やかに回収します。

すべての組織を回収した後、チューブを3〜4回反転させ、組織が底に沈殿するまで待ちます。この工程により、DMSOが十分に希釈されます。

組織が沈殿したら、上清を可能な限り吸引します。次に、温めた新鮮な1X HBSSを10 milliliters加えます。さらに、0.25% trypsinを300 microliters、DNaseを50 microliters加えます。

組織を緩やかに撹拌して分散させ、組織の解離後に濁った細胞懸濁液を作成します。温めたDMEMに10%濃縮ウシ血清を加えることで酵素活性を停止させ、細胞懸濁液を1200 Gで5分間遠心分離します。細胞ペレットを新鮮なDMEMおよび10%EBSで再懸濁し、ポリリシンコートプレートに播種します。

細胞をディッシュに30分間付着させます。その後、培地を新鮮な10% EBS添加DMに交換します。24時間後、DM含有培地をN2およびB27を添加したNeurobasal培地に交換し、10日間培養します。

以上で、皮質組織ブロックの日常的な凍結保存に関する、広範で効率的かつ信頼性の高いプロトコルについて詳しく説明しました。それでは、研究の成功をお祈りします。