骨格筋からのミトコンドリア単離

この手順の全体的な目的は、ミトコンドリアを単離し、ミトコンドリア呼吸を測定することです。まず、Sprague Dawleyラットから骨格筋を採取します。次に、その筋肉をホモジナイズし、遠心分離によってミトコンドリアを単離します。

その後、ブラッドフォード法を用いてタンパク質濃度を決定します。最後に、ポリグラフ法によりミトコンドリア呼吸を測定します。これにより、異なるミトコンドリア呼吸状態における酸素消費量を示す結果を得ることができます。

この手法は、ミトコンドリア機能に対するさまざまな介入の影響など、骨格筋分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法は骨格筋の代謝に関する知見を提供しますが、肝臓、脳、腎臓、あるいはほぼあらゆる組織など、他の臓器にも適用可能です。手順を開始する前に、骨格筋を単離するための以下の溶液を調製してください：PBS、10 mM EDTA添加PBS、8×ミトコンドリア単離バッファー、単離バッファー1（IB1）、単離バッファー2（IB2）、および実験バッファー（EB）。

手順については、付属の書面によるプロトコルを参照してください。次に、遠心機を起動し、温度を4°Cに設定します。ウォーターバスを起動し、温度を37°Cに設定します。

適切なバケツに、10 mLビーカー3本、ポッター・エルボー、組織ホモジナイザー、小型手術用ハサミ、および10 µLマイクロ遠心チューブを入れ、氷上に置きます。実験中はすべてを氷冷状態で維持する必要があります。IB oneおよびIB twoを氷上に置き、EBを温水バスに入れます。

次に、氷上の3つのビーカーに以下の溶液を加えます。ビーカー1には10 mLのPBS、ビーカー2には10 mLのPBSEDTA、ビーカー3には3 mLのib.1を加えます。まず、地域の機関動物ケアおよび使用委員会（IACUC）によって承認された手順に従って、ラットを安楽死させます。

次に、ピンセットとメイヨークレ scissorsを用いて、骨格筋を250から500 milligrams迅速に分離します。それをbeaker 1で洗浄し、次いで筋肉をホモジナイズするため、beaker 2に移動させます。まずbeaker 3に移し、最後にハサミで細かく刻みます。

溶液をPotter-Elvehjemホモジナイザーに移し、チューブを常に氷上に置いた状態で、電動ペッスルを用いて筋肉を10回ホモジナイズします。次に、ホモジネートをあらかじめ冷却した2 mLマイクロ遠心チューブに移し、4 °Cで700 ×gにて10分間遠心分離します。上清を新しい冷却済みマイクロ遠心チューブに移し、ペレットは廃棄します。

4°Cで10分間、10,500 Gsで遠心分離し、その上清を新しいマイクロ遠心チューブに移して、「SN1」および筋肉の種類を記載してラベルを貼ります。ペレットを500 µLのIB2に懸濁させ、4°Cで10分間、10,500 Gsで遠心分離します。上清を新しいマイクロ遠心チューブに移し、「SN2」および筋肉の種類を記載してラベルを貼ります。

最終的なミトコンドリアペレットを100 µLのIB twoに懸濁させます。ミニ遠心機で数秒間遠心分離します。ペレットが生じた場合は、上清を新しいあらかじめ準備したマイクロ遠心チューブに移し、ペレットは廃棄してください。酸素電極の校正はこのプロトコルにおける重要なステップであり、毎日行う必要があります。

電極の校正はミトコンドリアの分離中に完了させることができます。まず、250 mLのフラスコに100 mLの蒸留水を加え、20分間激しく撹拌します。水を大気ガスと平衡させるために、GRAT電極を50%塩化カリウム数滴で覆います。

次に、電極の上に青色のRizlaローリングペーパーの小さな断片を置きます。続いて、ローリングペーパーの上にPTFEメンブレンの断片を置きます。

リングアプリケーターを使用してインナーリングを装着し、次にエレクトロード溝にアウターリングを配置します。電極を接続し、大型プラスチックリングベース、ミトコンドリアチャンバー、およびウォーターホースを組み立てます。GRATボックスの電源を入れ、GRASソフトウェアを起動します。

平衡化した水をミトコンドリアチャンバーに加えます。次に、スターバーを加え、スターバーを回転させます。ハードウェアをクリックしてください。

次に、攪拌を開始します。回転数を60に調整し、オンをクリックしてください。その後、新しい実験を開始します。

「calibrate（校正）」をクリックし、次に「liquid phase calibration（液相校正）」を選択します。ボックス1の温度を37 °Cに変更し、「okay」を2回クリックします。「override」が「okay」に変わったら、それをクリックして窒素ガスタンクを開きます。

窒素タンクに接続したチップをチャンバー内に配置し、酸素濃度をゼロにします。オーバーライドから切り替わったら、「OK」をクリックします。水を吸引し、ミトコンドリアチャンバーに 500 µL の EB を加えます。

プランジャーでチャンバーを密閉します。複数のボックスを使用する場合は、各ボックスに対してキャリブレーションの手順から繰り返してください。新しい実験を開始し、約1分間走らせます。

信号を安定させるため、各チャンバーの量が150 microgramsになるよう、必要な量のミトコンドリア懸濁液を添加します。イベントをマークし、そのまま走らせます。1分間、温めた250 millimolar glutamateおよび125 millimolar malateを10 microliters添加し、最終濃度が5 millimolar glutamateおよび2.5 millimolar malateとなるようにマークして、1分間走らせます。

これを状態2と定義します。次に、最終濃度が 150 µM になるように、10 mM ADP を 7.5 µL 加えます。その後、マークして 30 秒間走らせます。

これをステート3と定義します。10 mM ADPをさらに 7.5 µL 添加し、1.5 分間測定します。次に、最終濃度が 1 µM となるように、冷却した 10 mM オリゴマイシンを 0.5 µL 添加し、3 分間測定します。

これをステート4と定義します。最終濃度が0.2 µMとなるように、冷えた0.1 mM FCCPを1 µL加え、3分間RUMさせます。これをステート5と定義します。

完了したら、実験を終了して保存します。raftソフトウェアを用いて呼吸速度を取得してください。正規化係数を入力します。

150 µgのミトコンドリアタンパク質を添加した場合、標準化係数は0.15になります。異なる呼吸状態における標準化呼吸速度を算出してください。ステート3をステート4で除して、呼吸制御比（RCR）を算出します。

この図は、骨格筋ミトコンドリアによる酸素消費量の代表的なトレースを示しています。電極信号が安定した後、ミトコンドリア試料をGRATチャンバーに添加します。状態2において、グルタミン酸とリンゴ酸の添加により呼吸が開始されます。

ADPの添加により酸素消費量が増加します。これを状態3と定義します。リガマイシンの添加によりATP合成酵素を阻害することで、状態4の呼吸を得ます。

最後に、ミトコンドリア呼吸を脱共役させるためにFCCPを添加します。この図は、ステート2、3、4、および5における代表的な酸素消費速度を示しています。各実験において、呼吸制御比（RCR）が算出されます。

RCRが4より大きい場合は、生存可能なミトコンドリア調製物である証拠と見なされます。本手順を行う際は、ミトコンドリアサンプルを常に氷上に保持することが重要です。本手順に従ってください。

ミトコンドリアタンパク質の含有量など、さらに詳細な疑問を解決するために、ウェスタンブロットなどの他の手法を実施することも可能です。このビデオを視聴することで、骨格筋からのミトコンドリアの単離方法およびミトコンドリア呼吸について十分に理解できるはずです。