日立F - 7000蛍光分光光度計とPicoGreen色素を使用してdsDNAの定量化

この手順の全体的な目的は、マイクロプレートリーダーを備えたF 7,000蛍光分光光度計を用いて、Pico Green染料による二本鎖DNA定量を行う能力を実証することです。まず、サンプルと試薬を準備します。次に、装置の設定を行います。

手順の3番目のステップは、マイクロプレートリーダーにサンプルをロードすることです。手順の最終ステップは、標準試料およびサンプルの測定を行うことです。最終的に、線形的な検量線を示す結果が得られ、これを未知サンプルの2本鎖DNA定量に使用することができます。

Hitachi F 7, 000 スペクトラ蛍光光度計の電源を入れ、キセノンランプを1時間ウォームアップさせます。Excelで標準試料とサンプルのデータファイルを作成し、カンマ区切り値（CSV）形式で保存します。まず蛍光光度計をセットアップするために、分析メソッドウィンドウを開くメソッドボタンをクリックします。

測定フィールドのプルダウンメニューから「photometry」を選択します。次に、「quantitation」タブをクリックしてください。「quantitation type」フィールドで「wavelength」を選択し、指定した波長を用いて蛍光測定を行うことを設定します。

校正タイプは「1次（first order）」を選択し、波長数は「1」を選択します。濃度単位には「ng/mL」を入力してください。「手動校正（manual calibration）」および「原点を通る曲線（force curve through zero）」のチェックボックスがオフになっていることを確認します。小数点以下の桁数には「2」を選択し、下限濃度リミットに「0」、上限濃度リミットに「10,000」を入力します。

次に、「instrument」タブをクリックし、「data mode」フィールドで「fluorescence」を選択します。「chopping speed」フィールドはリン光測定にのみ使用されるため、非アクティブであることを確認してください。「wavelength mode」フィールドでは、「WL fixed」を選択し、「ex WL」フィールドに 480 nanometers、「EM WL」フィールドに値を入力してください。

520 nanometersを入力します。EXおよびEMの下にある他のフィールドはすべて非アクティブのままにします。exスリットとEMスリットの両方を5.0 nanometersに設定します。

プルダウンメニューを使用して、「PMT voltage one to 1000 volts」のフィールドのチェックボックスは未選択のままにします。PMT voltageについては、プルダウンメニューから700 voltsを選択してください。また、auto statistic calc numberには2を、replicatesには1を、integration timeには0.1 secondsを、delayには0を選択してください。

次に、モニタータブを開き、Y軸の最大値を10,000に、Y軸の最小値を0に設定します。続いて、「データ収集後のデータ処理を開く」の左側にあるボックスを選択し、必要に応じて、測定完了後にレポートを自動的に印刷するための「データ収集後にレポートを印刷」の左側にあるボックスを選択します。最後に、解析メソッドウィンドウの各タブで選択したすべてのパラメータを保存するため、「全般」タブをクリックし、指定した場所に新しいファイル名で保存します。

OKボタンをクリックしてこのウィンドウを閉じます。これで機器テストパラメータの設定は完了です。マイクロプレートリーダーを設定するには、MPRボタンをクリックしてMPR設定ウィンドウを最前面に表示させてください。

まず、標準試料用のウェルを選択します。例えば、A1の位置をクリックし、マウスをE1までドラッグします。次に、標準試料設定ボタンをクリックします。

これにより、緑色で強調表示された標準物質に使用するポジションが選択されます。次に、サンプルのポジションを選択します。同様に、プレート上の対応するポジションをマウスでクリックしてドラッグし、「sample set」ボタンをクリックすると、選択したポジションが自動的に黄色で強調表示されます。

目的のサンプル測定位置に対して、同様の操作を繰り返します。標準品およびサンプルの情報を、あらかじめ準備したカンマ区切り変数ファイルにロードするには、MPRセットアップウィンドウのウェル情報タブをクリックしてください。

「load well information」ボタンを選択すると、Windowsエクスプローラーのウィンドウが開くので、ウェル情報の.csvファイルを指定します。情報を読み込むと、ウィンドウにテーブル形式で表示されます。Pico Green試薬のワーキングソリューションを調製するには、200 X Pico Green試薬 50 µLをTEバッファー 9.95 mLに加えます。

標準曲線を作成するために、TEバッファーを用いてLambda 2本鎖DNAを段階希釈し、最終濃度が1～100 ng/mLとなるように調製します。各標準試料を150 µLずつ、96ウェルプレートの指定されたウェルに分注します。次に、各テストサンプルを150 µLずつ、プレートの対応する指定ウェルに分注します。続いて、マルチピペットを使用してPicoGreen溶液を各ウェルに150 µLずつ加え、溶液とDNAサンプルを混合します。

反応を進行させるため、プレートを暗所で2〜5分間静かにインキュベートします。MPRディスプレイ画面ボタンをクリックしてMPR設定ウィンドウを最前面に表示し、交換位置ボタンをクリックします。マイクロプレート保持プラットフォームが装置の前方へ移動します。マイクロプレートリーダーのドアを開き、A1ウェルを前方に向けた状態で96ウェルプレートを保持プラットフォームに設置し、マイクロプレートリーダーのドアを閉じます。

「initial position」ボタンをクリックして、マイクロプレートのポジションAを測定位置に移動させます。「monitor display」ボタンをクリックして、測定ウィンドウをディスプレイの最前面に表示させます。「measure」ボタンをクリックして、標準試料および未知試料の測定を開始します。

良好な検量線は、F 7,000 ソフトウェアによって提供されるさまざまなパラメータを用いて評価されます。例えば、Pico green 染料を用いた二本鎖 DNA の定量で得られたこの理想的な検量線では、決定係数が 0.99993 と算出されています。説明したハイスループットシステムは、Pico Green 染料、マイクロプレートリーダーを搭載した日立 F 7,000 蛍光分光光度計、およびデータの収集、保存、解析、提示を自動化するソフトウェアプログラムを含む技術を直列に組み合わせたものです。

強力な技術を組み合わせることで、少量の2本鎖DNAを正確に分析するという高まるニーズに対応することが可能です。