内因性野生型BRCA1を発現する細胞を用いて相同組換えにBRCA1の変異の影響を識別

本実験の全体的な目的は、in vitro 相同組換えアッセイを用いて、BRCA1タンパク質の特定の変異体を検証することです。これは、まずBRCA1に特異的な短干渉RNAと、テスト対象のBRCA1変異体タンパク質を細胞に再発現させるためのプラスミドの両方をトランスフェクションし、内因性の野生型BRCA1タンパク質を変異体に置換することによって達成されます。第二段階として、試験細胞のDNAゲノム上の特定部位にDNA損傷を誘発するI-Sce1タンパク質を発現させるプラスミドに加え、上述の短干渉RNAおよび変異型BRCA1発現プラスミドを導入します。次に、DNA損傷と修復が行われるように細胞を2〜3日間インキュベートします。最終的に、GFP発現細胞のフローサイトメトリー分析に基づき、BRCA1タンパク質の特定のタンパク質変異体が相同組換えによるDNA修復において機能するかどうかを示す結果が得られます。

この手法は、相同組換えによるDNA損傷修復における特定のタンパク質変異体を分析するための汎用性の高いシステムを構築するために、2つの確立された手法を組み合わせています。既存の手法に対する本手法の主な利点は、従来の手法がBRCA1を遺伝的にノックアウトした細胞株に依存していた点にあります。本手法では、HELOC細胞由来のより扱いやすい細胞株を使用しており、RNA干渉による内因性タンパク質のBRCA1枯渇と、これらの細胞への試験用タンパク質の再導入を可能にしています。

バリアントBRC1タンパク質を発現させた状態で、相同組換えの試験を行います。一般的に、この手法に不慣れな方は、手順中の過剰な細胞死に苦慮することがあります。組換え反応の効果を最大化しつつ、細胞毒性を抑えるために、トランスフェクション条件を慎重に設定することが重要です。

本プロトコルの開始に先立ち、HeLa DR 13細胞株をP-D-R-G-F-Pを用いてHeLa細胞を形質導入することで作製しました。安定的に形質導入された細胞を選別するため、10 cmペトリ皿を用い、ピューマイシンを含む培地でこの細胞株を維持しました。P-D-R-G-F-Pプラスミドおよび安定形質転換体内の組換え基質には、2つの不活性なGFPアレルが含まれています。一方のアレルは、I-SceIの18塩基対の制限酵素認識部位が含まれているため不活性となっています。

そのコーディング領域において、これらの細胞でISCE1を発現させると、不活性なGFPの第2アレルに二本鎖DNA切断（DSB）が生じます。第1アレルのISCE1サイトに対応する配列部分は野生型です。この第2のGFPアレルは、DSBの相同組換え修復における配列ドナーとして機能し得、その結果、活性型のGFPアレルが生成されます。これは、最初のトランスフェクションの前日にフローサイトメトリーによって容易に検出可能です。

コンフルエンシーが90%以上のHeLa DR 13細胞を10 cmディッシュで調製します。1 mLのトリプシンを用いて、2〜3分間細胞を剥離させます。9 mLのDMEM-FBSを加えて反応を停止させ、ピペッティングにより細胞懸濁液を十分に混合します。24ウェルプレートの各ウェルに、0.5 mLのDMEM-FBSで希釈したトリプシン処理済み細胞を40 µLずつ分注します。細胞を37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。

1日目において、細胞のコンフルエンシーを40〜50%に調整しておきます。内因性b RCA oneを枯渇させるためのirnaと、B RCA one変異体発現プラスミドの両方をoptimum mediaで混合し、トランスフェクションを開始します。次に、これらの核酸をoptimum media中でlipと混合します。

メーカーの指示に従ってリポフェクションを行い、トランスフェクションを完了させます。細胞をインキュベーターに戻します。4〜6時間後、抗生物質を含まない培地で培地交換を行います。

細胞を戻し、2日目に一晩インキュベートします。各ウェルに0.3 mLのtryple trypsin試薬を加え、37 °Cで短時間インキュベートした後、トリプシン試薬中で細胞をピペッティングして細胞を剥離させます。トリプシン処理が完了したら、トリプシン活性を停止させるため、細胞を24ウェルプレートから2 mLのD-M-E-M-F-B-Sを含む6ウェルプレートに回収します。

初回トランスフェクションから2日後、これまでと同じ条件下で6ウェルプレートを一晩インキュベートします。SIR A、BRCA1変異体発現プラスミドDNA、およびISCE1発現プラスミドを62.5 µLのOptumで調製します。この溶液に2.5 µLのLIPECTOMY 2060と2.5 µLのOptumを混合します。

4〜6時間のインキュベーション後、細胞にトランスフェクションを行います。培地を抗生物質を含まないD-M-E-M-F-P-Sに交換してください。6日目に細胞をインキュベーターに戻します。

各ウェルの細胞に0.5 mLのトリプシン試薬を加えてトリプシン処理します。2 mLのD-M-E-M-F-B-Sを加えて反応を停止させ、室温で1000 RPMで5分間遠心分離して細胞を回収します。回収した細胞を1 mLの新鮮なD-M-E-M-F-B-Sで再懸濁し、1ウェルあたり10,000個の細胞を用いてGFP発現を解析します。

フローサイトメトリーにより、前方散乱光と側方散乱光のパラメータを用いて、生存している単一細胞をゲーティングします。GFP陽性細胞はGFP蛍光検出器を用いて選別し、結果をヒストグラムとして提示します。残りの細胞は、蛍光顕微鏡による写真撮影のために再播種することが可能です。

目的のBRCA1の顕微鏡観察において、BRCA1は相同組換えによる二本鎖DNA断裂の修復経路を制御します。相同組換えによる修復が行われた細胞は、蛍光顕微鏡によって容易に検出できます。RNAiによるBRCA1の枯渇は、検出されるGFP陽性細胞の急激な減少をもたらします。

FCAの結果は、x軸に細胞あたりのGFP強度、y軸に細胞数を示すヒストグラムとして出力されます。形質転換が行われていない、あるいは発現プラスミドを導入していないSCEでは、GFP陽性細胞は検出されません。

2列目から6列目の結果はすべて、3日目にISC one発現プラスミドをトランスフェクションした細胞から得られたものです。単一の実験における代表的な結果では、ISC oneの発現および無関係な遺伝子に対するコントロールRNAi枯渇後、15.5%の細胞がGFP陽性となりました。対照的に、BRCA oneの枯渇および空のプラスミドベクターの相補（add back）では、GFP転換率が0.7%まで低下しました。外因性野生型BRCA oneの添加により、15〜16%のGFP陽性細胞が得られ、相同組換え能が完全に回復しました。

同様に、別の意義不明の変異体の発現においても、BRCA1 21B変異はBRCA1依存的な相同組換え機能を完全に回復させました。一方、BRCA1 M18T変異体を導入した場合は、ベクターコントロールと同様の結果となりました。

このバリアントは内在性タンパク質と同程度のレベルで発現していたため、BRCA one M 18 T バリアントは相同組換えにおいて機能しないことが示唆されます。この手順を行う際は、細胞の増殖を監視することが重要です。細胞の増殖速度は遅く、コンフルエンシーも低いため、使用するトランスフェクション混合液の量を減らす必要があります。また、適切なタイミングでトランスフェクション培地を除去することも重要です。

トランスフェクション後の数日間、培地に抗生物質が含まれていると細胞毒性が高くなることがわかりました。そのため、1日目以降のすべての培地からは、調製後に抗生物質を除いています。この手法は、乳がん研究分野の研究者が、がんクリニックにおいて臨床的意義が不明であるBRC 1変異体の遺伝学を探索するための道を切り開きました。

本研究で開発した機能的なBRC oneアッセイにより、BRC one変異ががんの素因に及ぼす影響の予測精度が向上することを期待しています。