用ドリップ流れと回転円板の原子炉の使用黄色ブドウ球菌バイオフィルム分析

この手順の全体的な目的は、ドリップフローバイオフィルムリアクターまたは回転ディスクリアクターを用いて、低または中程度のせん断力の下で細菌バイオフィルムを育成することです。バイオフィルムリアクター内のクーポンにまず細菌を接種し、37 °Cでインキュベートして、細菌細胞を成長表面に付着させます。細胞がクーポンに付着した後、成長培地を流し、バイオフィルムの形成中に作用するせん断力を発生させます。

その後、成熟したバイオフィルムを回収し、解析および観察を行います。走査電子顕微鏡を用いることで、形成されたバイオフィルムの超微細構造を決定できます。私はブレイズ・ボールズです。

フローセルなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、高いバイオマス生産量と、同一の複数のバイオフィルムを容易に得られることです。本手順の実演は、私の研究室のテクニシャンであるRachel Stevensonと大学院生のKelly Schwartzが行います。ドリップフローバイオフィルムリアクターは、培地注入用の入力ポートと廃棄物排出用の流出ポートを備えた4つのチャンバーで構成されています。

各チャンバーの内部には、バイオフィルムを増殖させるための取り外し可能なクーポンが配置されています。ドリップフローバイオフィルムリアクターを組み立てるには、クーポンを各並列チャンバーに配置し、チャンバーの蓋を固定します。使用前にシステムを滅菌するため、組み立てたリアクターおよび流入栄養剤チューブをオートクレーブで滅菌してください。

また、滅菌済みのドリップフローリアクターに接種するため、バイオフィルム増殖培地をオートクレーブで滅菌します。装置を平らな面に置き、流出ラインをクランプします。次に、各チャンバーに10 millilitersの滅菌済みトリプチカソイブロスベースの増殖培地を満たし、100 microlitersのstaphylococcus aureusを添加します。

各チャンバーに個別に、同じ培地で培養した overnight culture を分注します。接種後のリアクターを 37 °C のインキュベーターに 18 時間置き、細胞をクーポン表面に接着させます。インキュベーション後、流出チューブのクランプを外し、リアクターを 10 度の角度に傾斜させた木製ブロック上に設置します。この操作は無菌的に行います。

流動 nutrient チュービングを、連続フロー nutrient ブロスが入ったボトルに接続します。チューブラインをポンプに通し、ポンプを全速で運転してチューブ内をプライミングします。流動チューブのプライミングが完了したら、ポンプを停止し、各チューブの末端に 22 gauge の 1 インチ針を取り付けます。

チャンバーのインレットストッパーをエタノール綿で無菌的に拭き取ります。インレットストッパーから針を挿入します。ポンプを起動し、培地がクーポン上に滴下するようにします。

約125 µL/minの流速で、培地がインレットストッパーポートからエフルエントポートに向かって下方へ流れるようにします。リアクターを連続フローで3日間運転し、適宜、適切に排液されているかを確認してください。

チャンバー内に培地が溜まっていないことを確認するため、目視で排水状態をチェックします。培地が溜まっている場合は、通常、流出チューブをピンチすることでバイオフィルム回収のための適切な排水が促進されます。ポンプを停止し、リアクターから針を取り外してください。その後、リアクターを平らな面に置きます。

3日間の連続流の後、黄色ブドウ球菌（staphylococcus aureus）のバイオフィルムは、接種したクーポンに沿って広がる黄色のバイオマスとして現れます。バイオフィルムの走査電子顕微鏡写真では、staphylococcus aureusが表面結合バイオフィルムコミュニティとしてクーポンを覆っていることがわかります。得られたバイオマスを定量するために、滅菌鉗子を用いて無菌的にクーポンを取り出し、セルスクレーパーで細菌を回収し、5 mLの滅菌PBSを含むコニカルチューブに移します。

組織ホモジナイザーを使用して、均一な懸濁液が得られるまで細菌の凝集体を分散させます。コロニー形成単位は、triptych soja agarプレートに段階希釈液を塗布し、37 °Cで24時間培養してコロニー数をカウントすることで定量します。回転ディスクバイオフィルムリアクターは、増殖培地がポンプで送られるケモスタットで構成されています。

スターバーを備えた回転ディスクと、そのディスクに適合するように設計された18枚のクーポンです。リアクターを組み立てるには、まず回転ディスクのスロットにクーポンを装着します。次に、クーポンを装着したディスクをオーバーフローポート付きの1リットルガラスビーカーに入れ、培地流用の孔と通気用の孔がそれぞれ1つずつ開いた15番ゴムストッパーでリアクターを密閉します。

システムを滅菌するため、オートクレーブで組み立て済みのリアクターと入口チューブを処理します。リアクターに接種するには、ビーカーに250 millilitersの滅菌培液を満たし、triptych soy brothで overnight培養したstaphylococcus aureusの培養液を500 microliters加えます。リアクターを250 rotations per minuteに設定したスターラープレートに置き、37 degrees Celsiusで overnightインキュベートして、細胞をクーポンに付着させます。

一晩のインキュベーション後、入口チューブを培地リザーバーのポートとペリスタルティックポンプに接続します。ポンプの電源を入れ、流量を0.25 milliliters per minuteに設定します。リアクターを37 degrees Celsiusで24時間作動させ、得られたバイオフィルムを回収します。

リアクターを停止させ、無菌的に操作します。クーポンに触れないようにディスクを取り出します。滅菌済みピンセットを使用してクーポンを取り出し、抗菌化合物の試験に向けて、緩く付着している細菌を除去するために、各クーポンを滅菌済みPBSに慎重に浸します。

無菌的に、目的の化合物を含む96ウェルプレートの各ウェルにクーポンを配置します。プレートを37 °Cで4時間インキュベートします。その後、クーポンを1×PBSを含む1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、ホモジナイザーを用いてバイオフィルムを分散させます。

最後に、前述の手順に従って、細胞の段階希釈液を栄養寒天培地に塗抹し、サンプルあたりの生存コロニー形成単位数を測定します。このグラフは、回転ディスクリアクターを用いて作製し、過酸化水素に曝露させたバイオフィルムにおけるコロニー形成単位数を示しており、最大18個の同一なバイオフィルムを作製できる能力を示しています。回転ディスクリアクターを使用することで、この手法は抗菌化合物の試験に最適となります。

このビデオを視聴することで、ドリップフローおよび回転ディスクリアクターを用いたバイオフィルムの作製方法について深く理解することができます。これらのバイオフィルムリアクターは、フローセルやマイクロタイタープレートを用いたバイオフィルム作製に代わる選択肢となり、大量のバイオフィルムバイオマスが必要な場合や、形成済みのバイオフィルムに対して抗菌試験を行いたい場合に最適です。