膵島質量、サイズ分布とアーキテクチャのコンピュータ支援大規模可視化と定量化

本手順の全体的な目的は、限られたサンプル内から偏りのない代表的なデータを収集し、組織の複雑な三次元構造を精密に解析することです。これは、まず免疫組織化学的に染色された膵臓切片の仮想スライスをキャプチャすることで達成されます。次に、Image JソフトウェアのIHC仮想スライスマクロを用いて仮想スライスを定量化し、Mathematica用に作成されたスクリプトでデータを解析します。

次に、Image Jを用いて仮想スライスの3D再構築を行います。手順の最終ステップとして、Slidebookソフトウェアを使用して個々の膵島画像のスタックをキャプチャし、Stereo Investigatorを用いて画像スタックを3次元的に手動でマッピングします。最終的に、3Dイメージングと手動マッピングを組み合わせた手法により、各膵島細胞の3D座標を伴う精密な膵島構造を得ることができます。この手法は、生理学的および病態生理学的条件が膵β細胞量、膵島の分布、および構造にどのように影響するかなど、肥満および糖尿病研究分野における重要な疑問への回答に寄与します。

β細胞量の変化をより深く理解することは、治療的介入の開発と評価を促進するため、本手法の意義は肥満や糖尿病の診断または治療にまで及びます。本研究で述べた手法は具体的に膵臓の動的な免疫組織化学的解析への洞察を提供するものですが、他のさまざまな生物や組織にも適用可能です。コンピュータ支援解析の手順は習得が困難であるため、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。

2次元および3次元でこのような大規模なデータセットを解析することは複雑であるため、本手順では、まず化学染色を施した膵臓の免疫組織切片全体を載せた清潔なスライドを蛍光顕微鏡のホルダーに設置します。Stereo Investigatorソフトウェアを起動し、「acquisition」をクリックしてサンプルを可視化してください。

次にライブイメージングを行います。蛍光強度を表示するビデオヒストグラムウィンドウを使用して、各チャンネルの露光レベルを決定します。この例では、チャンネル2をDAPIに、チャンネル3をGFPに、チャンネル4をRFPに、チャンネル5をsci5に、そしてチャンネル6をSCI7に使用しています。

カメラ設定ウィンドウを使用して、蛍光強度が減衰するように露光レベルを調整します。ビデオヒストグラムの右端を確認しながら、顕微鏡のフォーカスホイールでピントを合わせます。バーチャルスライスを作成する前に、サンプルの外側の画面上の点をクリックしてサンプルの輪郭を囲み、参照点を設定します。

次に、輪郭が完了したらサンプルの輪郭に沿ってクリックします。輪郭が閉じたら、右クリックして「close contour」を選択し、始点と終点を接続します。「acquisition」を選択してサンプルの仮想スライスをキャプチャし、「acquire virtual slice」を実行します。仮想スライスのウィンドウオプションが開いたら、「high speed acquire」を選択し、「manual」を無効にします。

「manual」の横にあるチェックボックスを外してフォーカスを合わせます。ファイルを保存します。右クリックして「add to focus site list」を選択し、prefoをキャリブレーションします。

仮想スライスのプレビュー画面で、ランダムに数箇所の手動フォーカスを行います。複数の部位のフォーカスが完了したら、右クリックして「Start virtual slice with prefo」を選択し、仮想スライスを開始します。最初のサンプルの仮想スライスが完了した後、次のチャンネルに切り替え、適切に露光時間を調整します。この手順を各チャンネルで繰り返し、アイレットの定量化を行います。その後、「I-H-C-V-S」という名称のImageJマクロを用いて画像を処理します。このマクロは、まず読み込んだ画像を解析用に準備し、次いで細胞組成などのアイレットの特徴を定量化します。

I-H-C-V-Sマクロは、スタックをそれぞれのカラーチャネルに分割します。ImageJで各画像を8ビットの白黒マスクに変換します。その後、自動的な強度閾値設定を行い、分割されたチャネル画像を算術的に加算して複合マスクを作成します。

その後、コンポジット画像に対してImage Jの組み込み粒子解析を行うことで、1つのβ細胞よりも小さい粒子を除外しながら、関心領域（ROI）を特定します。Image Jを用いてROIの定量化を行うことで、細胞パラメータのスプレッドシートが作成されます。

集計した結果をExcelスプレッドシートに保存します。各アイレットの面積、周囲長、円形度、Fer径、およびアイレット中心などのデータを、画像に付与された対応する番号とともに保存してください。これらのパラメータの計算分析は、書面によるプロトコルに記載されている通りに実施できます。アイレットの分布や頻度分析などの情報を明らかにするには、ディレクトリ内のすべてのJPG画像をTIFファイルに変換するスクリプトを実行し、仮想スライスによる3D再構成を行います。TIF形式は、仮想スライスから3次元スタックを構築し定量化するために使用される形式です。

ここでは、I MJ two two tiffというスクリプトを使用します。このスクリプトをJP2画像が含まれているディレクトリにコピーしてください。コンソールにdot slash I am JP two two TIFFと入力し、Enterキーを押してLinuxシェルでスクリプトを実行します。

キャプチャしたすべての画像がJPEG 2からTIFFファイルに変換されたら、ImageJでの解析に使用できるようになります。ImageJを使用して、最初のサンプル（本例ではヒト胎児膵臓）のすべての画像を開き、[Image]、[Color]、そして[Merge Channels]を選択して、それらを1つの画像に統合します。この工程を各サンプルに対して繰り返し、すべてのサンプルを単一の画像として統合します。ポリゴン選択ツールを使用して不要な領域を選択し、画像をクリーニングします。

「Edit」を選択し、「Fill」を行うことで塗りつぶします。次に、各画像をRGBカラー画像に変換します。最後に、画像からスタックを作成し、stack regプラグインを用いてさらにアライメントを行います。

最終的に、チャンネルをマージして画像を統合することで、膵臓全体のすべてのアイレットの3Dモンタージュが作成されます。画像スタックを収集するには、膵臓アイレットのホールマウント標本を顕微鏡下に設置します。水浸用対物レンズを使用する場合は、水を滴下してください。

スライドブックソフトウェアを開き、フォーカスコントロールウィンドウでCtrl + Shift + Eを押して、キャプチャおよびフォーカスコントロールにアクセスします。アイレットの大きさに応じて、対物レンズを20倍または40倍に設定してください。顕微鏡の接眼レンズを使用してアイレットを特定するには、binを2倍に設定し、フィルターセットをuser 1に設定します。

フォーカス制御ウィンドウで、エミッション選択を100%Eyesに設定し、ニュートラル密度をGFP eyの1クリック分に設定します。次に、スライドブックでサンプルを可視化するためにフロアを開き、フォーカス制御ウィンドウに戻ってフィルターセットをfixに切り替えます。その後、G-F-P-D-Sをクリックします。ジョイスティックを使用して、カメラ1ウィンドウ内でアイレットを可能な限り中心に合わせます。

細胞が容易に識別できるアイレットの中心付近の深さに焦点を合わせます。フォーカス制御ウィンドウでzabを選択します。スコープ制御を使用して、構造が明確に識別できるアイレットの最上部の深さまでスクロールし、set topをクリックします。

アイレットの最下部までスクロールし、「set」をクリックします。最下部をクリックして実行してください。キャプチャウィンドウのリファレンスポイントに戻るには、「advanced」をクリックし、次に「alternate to channel mode」をクリックします。

ウィンドウの右側で、ビンファクターを2倍に、キャプチャタイプを3Dに設定し、「use top and bottom positions」および「return to center volume after capture」をクリックして有効にします。ステップサイズを3に設定します。フィルターセットボックスの下にあるフィルターセットを「live」に設定します。

DAP、E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-U、およびSCIの5つのDSUを選択します。それぞれについて、「adjust exposure」にある「find best」をクリックします。次に、「test」をクリックし、選択した露光量が適切であることを確認します。

「Start」をクリックしてキャプチャを開始します。キャプチャが完了したら、必要に応じてレベルを調整し、RFPの表示色を白に変更します。スライドを保存し、「view export TIFF series」に移動します。

スライド名を入力し、最後にハイフンを付けて保存します。多数の個別のTIFファイルが作成されるため、各アイレットの画像スタックを別々のフォルダに保存しておくと便利です。画像スタックをマッピングするには、Stereo Investigatorソフトウェアを開いてください。

画像スケーリングメニューで画像スタックを開き、画像を可視化します。2倍の屈折を補正するため、画像間の距離を3 µmに設定します。Slidebookで「XおよびYスケーリングを上書き（override X and Y scaling）」を選択し、XおよびYスケーリングのソースとして「指定（specified）」を使用します。

X中心およびY中心の両方に0.65と入力し、ズームボタンをクリックして画像を拡大します。次に、マクロウィンドウ内の目的の島の中央で、少なくとも1つの細胞をマークしてください。適切なマーカーを使用すると、ベータ細胞は緑色に、アルファ細胞は赤色に、そしてデルタ細胞は白色に表示されます。

核の中心にマークを付けます。サンプルがDPIで染色されている場合、核は青色に表示されます。マーカー2でβ細胞を、マーカー5でα細胞を、マーカー6でδ細胞をそれぞれマークしてください。少なくとも1つの細胞にマークを付けたら、トップメニューのアイコンを使用して直交表示（orthogonal view）を表示し、「Z filter」と「symmetric」にチェックを入れます。

レンジを15.00に設定します。Z軸の0.0から開始し、マウスホイールを使用してアイレットをスクロールさせ、各細胞に適切なマーカーで印を付けます。各細胞の深さの中央に一度だけ印を付けてください。各Zレベルのマーキングが完了したら、Zフィルターのチェックボックスのチェックを外すことができます。

これにより、すべてのZレベルのすべてのマーカーが表示されます。すべての細胞にマークを付けたら、ファイルをDATファイルとして保存してください。次に、「ファイル」から「エクスポート」の「トレーシング」を選択します。

トレースをTXTファイルとして保存します。最後に、新しいアイレットのマッピングを試みる前に、「new data file」をクリックしてワークスペースをクリアしてください。免疫組織化学染色を施した膵臓サンプルから仮想スライスを作成することで、膵臓全体のα細胞、β細胞、およびδ細胞などの内分泌細胞をアイレットとしてまとめて検査することが可能になります。インスリンの免疫組織化学染色は緑色、グルカゴンは赤色、ソマトスタチンは白色、DAPIは青色で表示されます。

その後、自動しきい値処理を用いて、画像を8ビットマスクに変換しました。ここに表示されているのはマージ合成画像です。ただし、仮想スライスを用いたアイレット分布の解析により、個別のチャンネルで個別に分析することも可能です。

ここでは、デルタ細胞、ベータ細胞、およびアルファ細胞を明らかにするために、各チャネルのビューを示します。各アイレット構造に番号を振り、青色でハイライトした複合マスクを用いて粒子解析を行いました。複合マスクの粒子解析の結果はデータテーブルとして出力され、検出された各アイレットについて、面積、周囲長、円形度、および各種直径などのパラメータが含まれています。これらのIDは、複合マスク上の番号付きタグに対応しています。

これらの画像を大規模に解析することで、アイレットの総数とサイズの分布ヒストグラムを作成し、α細胞、β細胞、およびδ細胞の面積を詳細に比較することができます。アイレットのマッピングおよび細胞組成と構造の数学的解析により、Stereo Investigatorにアップロードされたヒトアイレットの3D再構成画像スタックから、単一の焦点平面を抽出することが可能です。ここでは、β細胞を緑色、α細胞を赤色、δ細胞を白色、核を青色で示しています。

個別のアイレット（eyelet）をキャプチャした後、ここでさまざまな海面レベル（sea planes）においてアルファ細胞、ベータ細胞、およびデルタ細胞をマーキングします。ここでは、10 microns間隔の3つの異なる焦点面における蛍光画像と対応するマップデータを示しています。さまざまな面でアルファ、ベータ、およびデルタ細胞をマーキングすると、アイレットを3Dで可視化できます。ここに示しているのは、アイレットマッピングによって得られた座標に基づく、4分の1にスライスされたアイレットの3D再構成図です。

さらに、マッピングされたアイレットの自動数学的解析により、細胞組成と構造を表示することが可能です。ここでは、単一の細胞集団における2つの細胞間の細胞間距離の相対頻数を示しています。また、2つの異なる細胞集団間における細胞間距離の相対頻数も示しています。

また、α細胞からα細胞、β細胞からβ細胞、およびδ細胞からδ細胞への細胞間距離分布の累積確率も示しています。これらの確率に対してコルモゴロフ・スミルノフ（KS）検定を行うことで、対応するKS距離を得ることができます。習得すれば、組織切片全体の広範囲なイメージングと解析を4時間で完了させることが可能です。

組織ブロックの3D再構築は30分で完了できます。最終的に、適切に行えば3Dイメージングとマニュアルマッピングは4時間で完了します。本手順を行う際は、切片の高精度な免疫組織化学染色から開始することが重要です。

その後の解析の精度は、すべて生データに依存します。また、開発後のこのような大規模な解析を処理するために、コンピュータに少なくとも 8 GB の RAM が搭載されていることを確認してください。この手法は、肥満や糖尿病の分野だけでなく、標準的な病理学的解析を用いる多くの他の分野の研究者にとっても道を開くものとなりました。

この手法は、特にサンプル数が限られている場合に有用です。このビデオを視聴することで、標準的な手法を用いて、限られたサンプルサイズ内で偏りのない代表的なデータを収集する方法について十分に理解できるはずです。膵島分布の研究で示したように、特定の領域のみを選択すると、全体の状況を代表しなくなる可能性があります。