C2C12筋芽細胞を用いた生体エネルギープロファイル実験

本実験の全体的な目的は、XF 96 extracellular flux analyzerを用いて酸化代謝の複数のパラメータを測定し、生存細胞および単離ミトコンドリアにおけるミトコンドリアの機能状態を評価することです。これらのパラメータは、基礎呼吸、ATP turnover、プロトンリーク、および最大呼吸または予備呼吸能です。これは、C2C12筋芽細胞にミトコンドリア呼吸の特異的なモジュレーターを順次添加し、呼吸の指標である酸素消費速度（OCR）の変化、および糖新生を通じてATPを生成するグルコースから乳酸への変換を測定することで達成されます。

細胞におけるもう一つの主要なエネルギー経路は、ECARまたは細胞外酸性化率として測定されます。ミトコンドリアプロファイリングの結果を得ることで、細胞の寿命を決定する上でミトコンドリア機能が果たす中心的役割についての知見を得ることができます。こんにちは、私はデビッド・ニコルズです。

私は研究生活を通じてミトコンドリアを専門としてきましたが、私の研究において最も重要な装置は酸素電極でした。単離ミトコンドリアを用いて、さまざまな条件下での酸素取り込み速度を測定できれば、極めて重要な情報を大量に得ることができます。しかし、細胞、特にマルチウェルプレートやカバーガラス上で培養された細胞を対象とする場合、古典的な手法は通用しません。

これは大きな課題でしたが、数年前にマルチウェルプレートアッセイが開発されたことで、マルチウェルプレート形式で複数の細胞の呼吸を並行して解析することが可能になり、克服されました。本日ご紹介するのは、培養細胞における基本的なミトコンドリア生物エネルギー機能をモニタリングするために私たちが考案した、非常にシンプルながら情報量の多い実験です。まず、XF 96細胞培養プレートに、100 µLの増殖培地を用いて1ウェルあたり10,000個の細胞を播種し、10% CO2濃度の37 °Cインキュベーターに置きます。

細胞は、アッセイを用いて播種した後24時間でXF 96を用いてアッセイすることができます。ウィザードにより、以下のグループレイアウトを持つテンプレートが作成されます。1列目から12列目までのすべてに、10,000個のC2C12細胞が含まれています。

青色で示されたグループ1をコントロール細胞として使用します。赤色で示されたグループ2には、oligo Mycin、FCCP、およびrooneの薬剤を投与します。次に、プロトコルの記述部分に従い、X-F-D-M-E-Mアッセイ培地で化合物を調製します。

Oligo Mycin、FCCP、およびrotten knownを用います。これらの化合物はXF cell MIT stress test kitに分注済みです。XF prep stationを使用して、増殖培地をDMEMランニング培地に置換してください。

最後に、細胞を二酸化炭素を含まない37 °Cのインキュベーターで60分間インキュベートし、センサーカートリッジに注入する化合物を添加する前に、細胞をアッセイ培地で予備平衡化させます。また、化合物を37 °Cに温めておきます。その後、以下のようにインジェクターポートにロードします。カラム1から4については、ポートA、B、Cにそれぞれ16 µL、18 µL、20 µLのXFアッセイ培地またはDMEMをロードします。

5列目から12列目まで、ポートAに16 µLのoligomycinを、ポートBに18 µLのFCCPを、そしてポートCに20 µLのrotenoneをロードします。次に、プロトコルのコマンド設定で、ループ回数を3回に設定します。混合時間を3分に、測定時間を3分に設定してください。最後に、「Start」をクリックします。

画面上の指示に従い、キャリブレーション完了後にカートリッジをロードしてください。ユーザープロンプトに従って、実験用のセルプレートを追加します。その後、「continue」をクリックし、アッセイを実行します。

実験終了後、プレートを取り出します。本アッセイは、ミトコンドリア機能をプロファイリングするための古典的な実験から派生したものであり、さまざまな化合物が細胞代謝、ミトコンドリア機能、および全般的なバイオエナジェティクス活性に及ぼす影響を理解するための、より複雑な実験を構築するための枠組みとして機能します。ここでは、各化合物を順次投与した際に、酸素消費速度において期待される反応が観察されました。

ligamycine処理により、ミトコンドリア複合体VにおけるATP合成が阻害された結果、ATP量が減少しました。ligamycine処理後、細胞は酸化的にリン酸化によるATP合成ができなくなったため、ATP需要を満たすために解糖系へと移行しました。その結果、既報の通り、解糖系の指標であるECAR（細胞外酸性化速度）の上昇が観察されました。FCCPは脱共役剤として作用し、プロトンの再流入の制限を取り除きます。

呼吸が加速し、現在は電子伝達系によって制限されています。最後に、ロテノンがミトコンドリア複合体Iを阻害し、これにより電子伝達系における電子の流れが停止するため、酸素消費量は劇的に減少します。ここでは、細胞の基礎呼吸、ATP産生に充てられる酸素消費率、およびプロトンリークによるプロトン勾配の維持に充てられる量についての情報を取得します。

さらに、脱共役呼吸条件下での最大呼吸速度を得ることができます。これは時に予備呼吸能（spare respiratory capacity）と呼ばれます。そして最後に、ミトコンドリアのプロセスによるものではない酸素消費量を決定できます。以上が、Seahorseを用いた測定方法です。

XF 96は、細胞内ミトコンドリアのBIEエネルギー論に関する膨大な情報を得ることができる一連の実験系です。非常に重要である基本実験である「実験1」では、基礎呼吸、ATPターンオーバー、ミトコンドリアのプロトンリーク、および予備呼吸能に関する情報を得ることができます。これらのパラメータにより、細胞内ミトコンドリアのバイオエナジェティック状態に関する基礎的な情報を得ることが可能です。