オーラルバイオフィルムの包括的、生化学的構造とトランスクリプトーム評価のための分析ツールボックスは、ミュータンス連鎖球菌によって仲介

歯の表面に形成されるバイオフィルムは、非常に複雑で構造化されています。微生物コミュニティは細胞外マトリックスに包まれ、絶えず環境的な課題にさらされています。ここでの全体的な目的は、口腔内バイオフィルムの複雑な性質を考慮し、新しい蛍光イメージング技術とデータ処理・解析用のカスタムソフトウェアを組み合わせることで、構造的および分子的な研究を促進するために設計された分析ツールボックスの2つの特定のコンポーネントを示すことです。

これは、まずバイオフィルム、トランスクリプトーム、および構造解析のための特定のアッセイを選択することで達成されます。これには、EPSと細菌を同時に可視化するための新しい共焦点イメージング法が含まれます。手順の第2段階は、バイオアッセイから生データを収集することです。第3段階は、共局在解析のために新しく開発されたduo statを含む特定のソフトウェアを使用して、生データを処理することです。

最終ステップは、マイクロアレイデータマイニングおよび解析ソフトであるmicroarray data visualizer（MDV）などを用いて、プロセスデータを解析することです。最終的に、当センター独自の統合解析ツールボックスを使用することで、複雑な食事やホストとの微生物相互作用に反応して、口腔内病原体がどのようにトランスクリプトームとバイオフィルムの構造を変化させるかを示す結果を得ることができ、より包括的なバイオフィルム解析とデータ解釈が可能になります。こんにちは、私はロチェスター大学医療センター口腔生物学センターの准教授、ミシェル・ク（Michelle Kuh）です。

本日は、バイオフィルム解析のための分析ツールボックスをご紹介します。このツールボックスは、バイオフィルム細胞の構造や細胞外マトリックスとの配置、および複雑な環境ストレスに対するトランスクリプトームレベルでの応答方法など、バイオフィルム研究における重要な疑問を解決するのに役立ちます。私はJeanで、Ks博士の研究室のポストドク研究員です。

本日は、私たちのツールボックスのイメージング部分について実演します。こんにちは、Aise Kleinです。Dr.Kの研究室でリサーチ・アシスタント・プロフェッサーを務めています。

本日は、マイクロレイデータ解析用ソフトMDVについてご紹介します。この手順では、バイオフィルムを増殖させるための歯面代用物として、唾液でコーティングしたヒドロキシアパタイトディスクを使用します。まず、S. mutansを接種した培地2.8 mLを24ウェルプレートの各ウェルに加え、プレートを遮光し、最終濃度1 µMとなるようにデキストリン結合LOR 6 47染料を各ウェルに添加します。その後、ピペッティングを数回行い、染料を培地になじませて混合します。

次に、滅菌済みのピンセットを使用して、滅菌済みの唾液を塗布したヒドロキシアパタイトディスクを滅菌ABバッファーに2回浸して洗浄し、過剰な唾液や未結合の唾液成分を除去します。その後、ディスクを染料添加培地に垂直に配置し、各ディスクが完全に浸っていることを確認します。プレートをアルミホイルで覆い、5%二酸化炭素インキュベーター内で37°C、20時間インキュベートして、バイオフィルムを形成させ、接合テクスチャを細菌細胞によって産生されるエキソ多糖類に組み込ませます。

細菌細胞を最初に標識するために、各ウェルに 2.8 milliliters の滅菌 milli Q 水を入れた 24 ウェルプレートを用意します。各ウェルに cyto nine 染料を 1.5 microliters 添加し、最終濃度を 1 micromolar とし、プレートを遮光して保存します。バイオフィルムが形成されたら、ディスクが入ったプレートをインキュベーターから取り出します。

各ディスクを0.89%塩化ナトリウム溶液で洗浄します。次に、Cyto-9染料を含む新しいプレートにディスクを移します。プレートをアルミホイルで覆い、室温で30分間インキュベートします。

細胞の染色後、以前と同様にバイオフィルムを浸漬し、塩化ナトリウムで洗浄します。次に、ピンセットを使用して、ワイヤーからバイオフィルムを塩化ナトリウムを含むペトリ皿に放出します。ペトリ皿をアルミホイルで包みます。

これでバイオフィルムをレーザースキャニング共焦点顕微鏡を用いて可視化する準備が整いました。各バイオフィルムのランダムに選択した5〜10箇所をスキャンし、各位置でZシリーズを生成します。3D再構成を行うため、共焦点画像を開き、ミラーソフトを使用して処理します。

Amiraというプログラムを用いて作成された共焦点画像のこの3次元レンダリングは、実証された手順を用いて不活性表面上に形成されたS変異株のバイオフィルムを示しています。細菌細胞とマイクロコロニーが緑色で表示されており、これらはエキソ多糖類を含むバイオフィルムマトリックスに埋め込まれています。赤色では、選択した領域の拡大図を生成することができ、これにより微生物スケールにおける細菌とEPSの特異的な構造的関係を明らかにしています。

duos statプログラムを使用して、細菌や外多糖体などの個別のバイオフィルム構成成分の共局在量を定量します。まず、MATLABバージョン5.1で新しく開発されたduos statのパスを設定し、2つのバイオフィルム構成成分のZシリーズ画像が含まれる画像フォルダを開きます。次に、相関させ分析する2つのチャンネルを選択します。

2つのイメージスタックは、すべての次元においてピクセルサイズが同一であり、かつ各スタックの画像数が同じである必要があります。各チャネルのしきい値を設定し、ソフトウェアインターフェースの指示に従って、解析用のデータ処理ファイルにデータを入力してください。この図は、duo stackが細菌とDBSの空間的関係をどのように定量的に解釈するかを示しています。

バイオフィルム内において、Duo stackは、ここでの細菌を示す緑色の線とEPSを示す赤色の線のように、ディスク表面から液相までの細菌およびDPSの垂直分布を算出します。また、バイオフィルムの厚み方向における細菌とDPSの共局在も算出します。黄色の線で示されているように、データはバイオフィルムの深さ全体にわたって細菌よりもEPSの割合が高いことを示しており、ほとんどの細菌細胞は、特に中間層から上層にかけてEPSと関連しています。3Dレンダリングを備えたDuo statは、バイオフィルムにおける細菌とDPSの構造的組織化および相互作用への理解を深めます。

バイオフィルムから高品質なRNAを確実に得られるようにするため、2007年に発表されたCurian KUらの論文に記載されているバイオフィルム専用のプロトコルに従ってRNA抽出を行うことを推奨します。本ジャーナルでは、cDNAマイクロアレイの調製および定量リアルタイムPCRアッセイに、Analytical Biochemistryの標準プロトコルが用いられています。マイクロアレイ実験によって生成される大規模なデータセットの解析を容易にするため、我々はデータマイニングおよび組織化ソフトウェアであるmicroarray data visualizer（MDV）を設計しました。これはwww.oralgen.anl.govからオンラインで利用可能です。

データをMDVに送信する前に、オンラインで利用可能なBRB array toolソフトウェアを使用し、クラス比較のカットオフP値を0.001として、ランダム分散モデルを用いた対応のあるT検定などの統計解析を行ってください。この例では、3つの異なる糖濃度および4つのタイムポイントで生育させたs muttonのバイオフィルムの解析を実施しました。対応のある比較を行い、条件A（0.5%sucrose + 1%starch 対 1%sucrose）、条件B（0.5%sucrose + 1%starch 対 0.5%sucrose）、および条件C（0.5%sucrose 対 1%sucrose）の3つのBRBファイルを作成しました。

このパネルは、BRB array toolを用いた標準的なクラス比較によって、各条件およびタイムポイントで差分発現が検出された遺伝子数を示しています。その結果、BRB raw dataと呼ばれる大量の遺伝子リストが得られます。MDVのデモンストレーションとして、Excelを用いてタイムポイント30時間に着目します。BRB raw dataをMDVタブ区切りテキストファイルに変換してください。

遺伝子座タブ番号に付随する文字はすべて削除してください。例えば、名称がSMU dot 1432 Cの場合、文字Cを削除します。MDVを開きます。ファイルメニューを開き、アノテーションソースの選択（select annotation source）を選びます。ダイアログボックスが表示されたら、フラットファイル（flat file）オプションを選択してください。

参照ボタンを使用して、ジーンオントロジー（GO）番号に基づくパスウェイ機能分類データおよび遺伝子名のアノテーションを含むファイルを選択します。[ファイル]メニューから、MDV形式に変換された各ファイルをインポートしてください。各ファイルは、一つの実験条件を表しています。

各実験条件A、B、およびCで発現している遺伝子を比較します。この例では、ベン図機能を使用します。このデモンストレーションでは、ショ糖とデンプンの複合的な影響に特有な変動発現遺伝子に焦点を当てます。ベン図に基づく機能を用いて、これらの異なる条件下で発現している固有および共通の遺伝子数を可視化し、さらなる解析のために選択すべき遺伝子の特定に役立てます。

ここでは、条件Aおよび/またはBで特異的に発現変動している遺伝子のみを選択し、ここに灰色で示されているように、Cで検出された遺伝子は除外します。MDVを用いることで、解析対象となる全遺伝子数を大幅に削減すると同時に、実験ケースにとって関連のない遺伝子をフィルタリングすることができました。ファイルメニューからエクスポートオプションを選択し、データを保存します。

タブ区切りファイルとして出力されるため、これらのファイルをExcelで開き、データ出力を整理して目的のグラフ表示に変換することができます。Excelでデータを整理することで、MDVの出力を視覚的に表示することが可能になります。このグラフは、バイオフィルム形成の異なる段階において、デンプンとスクロースの組み合わせによって影響を受ける、機能的に独立した遺伝子サブセットの差分的発現の概要を示しています。

S変異体のトランスクリプトームへの影響は、バイオフィルム形成の他の時点よりも30時間後においてより顕著である。この結果により、時間的な影響を考慮することで遺伝子の選択およびその後の検証プロセスが容易になり、我々の作業仮説に関連する特定の機能的遺伝子サブセットを正確に特定することができた。この手順に続き、バイオフィルム内の生物の具体的な生理学的および代謝的応答はどのようなものであるかといった、さらなる疑問に答えるために、生化学的およびプロテオミクス的な手法を実施することも可能である。

このような包括的かつ統合的な解析は、非常にダイナミックで複雑な環境である鼻腔内において、バイオフィルムがどのように病原性を調節しているかをさらに理解するのに確実に役立つでしょう。詳細は、本ビデオ記事に添付されているPDFファイルをご参照ください。