マイクロパターン細胞を用いた薬物の効果の改善可視化と定量分析

本手順の全体的な目的は、特定の接着性マイクロパターン上で細胞の構造と位置を標準化することで、画像取得の自動化を容易にし、薬剤効果の感度が高く堅牢な定量化を伴う簡便な画像処理が可能になることを示すことです。これは、従来のガラスカバースリップ支持体では達成不可能なことです。具体的には、L字型のSI three標識マイクロパターンを持つSI twoチップにheli細胞を播種することで実現します。細胞は三角形の形態をとり、L字の両端にわたる主要なストレスファイバーを形成します。次に、パターン化された細胞をlebos statinで処理するか、または未処理のままインキュベートし、その後、固定および染色を行ってアクチン細胞骨格と核を可視化します。

その後、マイクロパターン細胞の画像を撮影し、cell refマクロを用いて処理することで解析用の画像スタックを生成し、さらにhypotenuseマクロを用いて表現型を定量化します。最終的に、標準的な細胞培養条件下では検出できない、低用量のBLEs statinがマイクロパターンHELOC細胞に及ぼす有意な影響を示す結果を得ることができます。こんにちは、ようこそ。

本日は、細胞分析における接着性マイクロパターンの使用方法を説明する実験プロトコルをご紹介し、これらの接着性マイクロパターンを用いることで、極めて低用量の薬剤を容易に定量化できることを示す実験データをご覧いただきます。これらのマイクロパターンを初めてご覧になれば、細胞分析中の画像キャプチャにおけるばらつきの問題をどのように解決できるか、すぐにご理解いただけるでしょう。マイクロアレイのように細胞を配列させることで、顕微鏡ステージを細胞から細胞へと容易に移動させ、段階的に画像をキャプチャすることが可能になります。

しかし、マイクロパターンの利点はそれだけではありません。さらに多くの改善点があります。実際、クロス型やY型などの典型的なマイクロパターンを用いることで、細胞内部の構造を標準化できるためです。つまり、オルガネラ、有糸分裂紡錘体、細胞骨格、およびさまざまなタンパク質ネットワークが、細胞間で同一の位置または同一の方向になります。これにより、これらの特定のパターンにおける薬剤の影響を予測し、定量化することが非常に容易になります。これは、一般的なペトリ皿やマイクロプレートを用いた従来の手法とは、かなり対照的なアプローチに思えるかもしれません。

通常、細胞が動き回り、さまざまな形態をとる様子が見られます。一方、接着性マイクロパターンの上では、すべての細胞がこの接着性マイクロパターンに反応し、同様の方法で構造を組織化するため、見た目が揃ってきます。これは実際には少し不自然に思えるかもしれませんが、詳しく考えてみれば、ペトリ皿の方がさらに不自然ではないでしょうか。

組織内では、細胞は隣接する細胞や細胞外マトリックスによって制約を受けています。そのため、細胞は多くの空間的な情報を受け取っており、それが細胞構造の方向性を決定づけています。マイクロパターンを用いることで、このような環境を再現しようとしています。

私たちはこの空間情報を細胞に復元しており、すべての細胞がこれに反応して同様に組織化しています。そして、すべての細胞が同様に見えるため、「参照細胞」という概念を導入することができます。つまり、すべての画像を平均化して単一の画像を得ることができ、それが特定の条件下における細胞の形態を真に代表するものとなります。その後、薬剤を添加して再度その参照細胞を確認することで、その薬剤に反応して細胞の形態や組織化がどのように変化したかを観察することができます。

Situ Twoチップ2個を、Situ Twoのロゴが読み取れるようにして、6ウェルプレートの独立した2つのウェルにそれぞれ配置します。本実験で使用するSitu TwoチップにはFibroGen SI 3で染色されたマイクロパターンが形成されており、使用前は暗所で保存してください。約80%コンフルエントになったHeLa細胞をトリプシンで回収し、顕微鏡下で適切に単一細胞に分散しているかを確認します。300 Gで4分間遠心分離し、細胞を穏やかに再懸濁してカウントし、15,000 cells/mLの濃度に希釈します。

不完全D-M-E-M-F 12培地を用い、1ウェルあたり60,000個の細胞を分注します。培地中に回転運動が生じると細胞が中心に集中しやすくなるため、プレートは極力動かさないようにしてください。フード内で10分間静置して細胞を沈降させた後、細胞インキュベーターへ移動させます。

細胞インキュベーター内で10～20分経過させます。10分後から細胞が付着し始めるため、顕微鏡下で定期的に細胞の付着状態を確認してください。細胞培地を交換し、以下の手順を4回繰り返して過剰な細胞を除去します。プレートを水平に保ったまま、ウェルの端から緩やかに培地を吸引します。

チップが乾燥するのを防ぐため、十分な量の培地を保持するように注意してください。4 mLのPBSを加え、チップの中央から吸引を開始します。その後、前回と同様にウェルの端に移動してPBSの大部分を吸引し、顕微鏡下で浮遊細胞がないか確認します。

浮遊細胞が多く残っている場合は、洗浄手順を繰り返します。細胞数が非常に少ない場合は、PBSの一部を吸引し、新鮮な培地2 mLで置き換えます。その後、新鮮な培地4 mLを2回添加します。細胞を細胞インキュベーター内で3時間インキュベートし、細胞を完全に展延させます。

この方法を用いると、マイクロパターンの10〜30%に単一の細胞が配置され、他のパターンは空であるか、または複数の細胞によって占められます。BLEs statinで細胞を処理するには、17 mMの薬剤ストック溶液を、4 mLの培地を用いて、0.1% DMSOを含む最終濃度5 µMまで希釈します。コントロールとして、0.1% DMSOのみを含む培地を調製します。チップの乾燥を防ぐため、細胞培地を吸引した後、速やかにBLEs statinまたはコントロール溶液に交換してください。

細胞を37°Cで1時間インキュベートします。このインキュベーションの間に、細胞骨格バッファーを調製します。2 mLのcbに1 gのスクロースを加えます。

これにより、細胞内部の構造を維持することができます。1 mLのCB sucroseを4 mLの5% PFAと混合します。そこに、CB sucrose溶液中のPFAを2 mL加えます。

未使用の6ウェルプレートの2つのウェルに準備します。細胞を固定するため、ピンセットでCY 2チップを拾い上げ、CBスクロース溶液で調製したPFA 2 mLが入った6ウェルプレートに配置します。室温で10分間インキュベートし、PFAを除去してPBSで細胞を1回洗浄した後、100 mM塩化アンモニウム 2 mLで細胞を10分間洗浄します。

残留するPFAの架橋活性を停止させるため、0.1% Triton X 100を含むPBSを2 mL加え、3分間細胞を透過処理します。PBSで2回洗浄した後、1.5% BSAを含むPBSに溶解した1:2000希釈のZI結合ファロイジン2 mLを用いてアクチンフィラメントを染色し、室温で1時間インキュベートします。その後、2 mLのPBSで細胞を1回洗浄します。次に、核を染色します。

1 mg/mL の hawked を含む PBS を 2 mL 加え、室温で 3 分間インキュベートします。2 mL の PBS で 2 回洗浄します。al などの封入剤を 25 〜 30 µL 使用し、2 枚のチップを標準的なスライドガラスに封入します。

3つの波長の画像を取得するために、MetamorphイメージングソフトウェアとNIK icon eclipse T顕微鏡を使用します。この顕微鏡には、CCD Hema Matsuカメラとintens lite水銀ファイバー照明装置が装備されています。まず、20倍の倍率を選択します。

次にメニューバーから「multidimensional acquisition（多次元取得）」を開き、実験のさまざまなパラメータを設定します。まず、データの保存先を指定してください。

波長数を3に設定し、SI 3波長を選択して、12個のマイクロパターンがカメラ視野の中心にくるようにカバースリップスライドを配置します。1視野あたりに可視化されるマイクロパターンの数は、カメラと対物レンズの設定によって異なります。各波長の露光時間とオートフォーカスを設定します。

PS 3について、多次元取得（multi-dimensional acquisition）を実行するジャーナルを作成し、「MDA jnl」として保存します。スキャンステージ機能を開き、12個のマイクロパターンを含む画像24枚を取得するように設定します。ジャーナルの設定画面で、列数に6、行数に4を入力し、xステップサイズを-400 micron、yステップサイズを300 micronに設定して実行します。保存したジャーナル「MDA jnl」をアップロードし、[scan]を押して、3つの波長における24枚の画像の自動取得を開始します。

このビデオでは、L字型のマイクロパターンを用いて、細胞の非接着部分を支持する単一の主要なアクチンストレスファイバーの形成を誘導します。これにより、平坦なフィブロネクチン上に定着した細胞と比較して、BLEsスタチンが細胞に与える影響の可視化と測定を簡略化します。自動画像処理および解析のために、オープンソースプログラムであるImageJ用に作成された2つのカスタムマクロについて説明します。1つ目のマクロは、RAW画像のスタックから個々の細胞を抽出し、参照細胞を作成します。2つ目のマクロは、細胞膜の崩壊を測定します。

最初のステップは、未処理の画像から個々の細胞をセグメンテーションすることです。蛍光標識されたマイクロパターンの画像を使用して、マイクロパターンを中心とした領域を切り出します。これは各波長の画像でクロップされ、波長ごとのスタックとして再構成されます。単一細胞を含むマイクロパターンを選択するため、マクロで画像あたりの核の数を検出し、核が複数あるか、あるいは核が存在しないものをすべてのスタックから除外します。

最後に、ImageJプラグインのmulti-stack regを使用して、収集したすべての画像およびすべてのチャネルをマイクロパターンの位置に基づいて再整合させます。このステップにより、個々の画像のラインスタックが生成され、これを単一細胞解析やリファレンス細胞の作成に使用することができます。ImageJでは、スタックからフィルタリングおよび整合済みの画像を投影することで、リファレンス細胞を構築します。

いくつかの投影法を適用できますが、通常は画像スタックの外れ値を除去するためにメディアン投影が選択されます。リファレンスセルは、マイクロパターンセルでのみ得られる、表現および画像解析に有用でユニークなツールです。その解析を容易にするため、ルックアップテーブル（LUT）を適用して、モノカラー画像をコード化された周波数マップに変換します。

BLEsのスタチン効果を特性評価するため、2つ目のImage Jマクロを用いて細胞の剛性と崩壊を解析しました。簡潔に述べると、Lマイクロパターンのしきい値画像を用いて、細胞の三角形形状の理論的な斜辺を定義します。次に、アクチン染色画像のしきい値処理を行い、細胞形状を定義します。

理論上の斜辺と実際の凹状の細胞膜との間の面積の差を測定し、理論上の斜辺よりも下の領域に面積を持つ細胞を、崩壊した細胞とみなします。5 µMのBLEs statinの影響を、処理群と対照群における崩壊細胞数を比較することで評価しました。BLEs statinで処理したLマイクロパターン細胞および未処理細胞の代表的な画像を示します。細胞は固定し、マイクロパターンを染色しました。

アクチン、核をそれぞれ赤、緑、青で示しています。コントロール条件と比較して、BLEs statinが細胞形態に及ぼす影響に注目してください。ここでは、プレーンなフィブロネクチン上でBLEs statinまたはコントロールとともにインキュベートした後の代表的な細胞を示しています。

細胞を固定し、アクチンと核をそれぞれ緑色と青色で染色しました。処理群と対照群の類似性に注目してください。BLEs statinで処理した細胞または未処理の参照細胞から得られた代表的な画像を示します。

本アプローチは、研究対象となる表現型を容易に観察できる可能性がある点に注目してください。以下に、マクロ低辺（macro hypotenuse）を用いたBLEsスタチンが細胞に及ぼす影響の解析例を示します。対照群の細胞では25%が崩壊していましたが、5 µMのBLEsスタチン処理細胞ではこれが3倍の75%に増加しており、アクチニン収縮ネットワークの弱体化を反映しています。

この動画を視聴することで、接着性マイクロパターンが高コンテンツ解析におけるいくつかのボトルネックをどのように解消するかがよく理解できたはずです。第一に、接着性マイクロパターンの使用により、画像キャプチャの処理解析が大幅に簡素化されました。第二に、マイクロパターンによって細胞の形態と挙動を標準化し、細胞間のばらつきを低減できるため、極めて低用量の薬剤による非常にわずかな影響まで検出することが可能になります。

そして最後に、細胞解析で良好な結果を得るために通常必要となる数千個の細胞に対し、当社のリファレンス細胞を使用すれば、わずか数十個の細胞で堅牢かつ有意な結果を得ることができます。