バインディング機構を決定するために、可変濃度等温滴定熱量計のデータセットの収集

この手順の全体的な目的は、高分子がそのリガンドに結合する現象を記述する適切な物理モデルを特定し、関連する熱力学パラメータを決定することです。まず、広範な透析を行うことで高分子のストック溶液を調製します。次に、目的のリガンドを最終透析バッファーに溶解させ、2番目のステップですべての構成成分の濃度を決定します。

高分子およびリガンドの試料を、一連の異なる濃度に注意深く希釈します。次に、一連の等温滴定カロリメトリー（ITC）実験を、リガンドとタンパク質の両方をいくつかの異なる濃度で実施し、本手順の最終ステップとして一連のITC等温線を作成します。これら一連の実験結果に対し、異なる物理モデルを用いてグローバル解析を行い、全体として最も適合度の高いモデルを正解として特定します。

本日は、タンパク質分子がどのようにリガンドと結合するかといった生物物理学的な疑問に応え、エントロピー、エンタルピー、結合定数などの結合パラメータの正確な測定を可能にする手法をご紹介します。このプロトコルを開始する前に、目的のタンパク質を精製してください。今回のデモンストレーションで使用する高分子は、immuno GLYCOSIDE N six prime、a subtle transferase one IまたはC six prime one Iです。まず、4 Lの透析バッファーを調製し、4 °Cまで冷却します。次に、少量の高分子溶液を透析させます。

本例では、4 °Cにて、1.3 Lの透析緩衝液に対し5 mLの400 µM AAC C six prime, one eyeを添加します。この操作はコールドルームまたは冷蔵庫内で行ってください。8時間ごとに新鮮な緩衝液に交換し、計3回透析を行います。最終的な透析溶液を保存してください。

最終透析液750 millilitersを0.45 micronのセルロースフィルターでろ過し、4 °Cで保存します。このバッファーは、以降ランニングバッファーと呼び、洗浄液および希釈液として使用します。サンプルの調製については、0.2 micronのシリンジフィルターをランニングバッファーで十分に洗浄してください。

タンパク質試料を適用し、ろ過します。タンパク質溶液を保存する前に、コニカルチューブに試料を静かに回収し、標準的なタンパク質定量法でタンパク質濃度を決定します。本例では、280 nanometersでのABSORBENCE（吸光度）によってタンパク質濃度を測定し、酵素濃度を算出します。

EXIプロテオミクスサーバーで算出した消衰係数を用いて、長期安定性を最大限に高める方法でタンパク質を保存します。AAC C six prime one eyeは、凍結融解後に活性が保持されないため、4 °Cで保存する必要があります。次に、リガンドとランニングバッファーを溶解させます。本デモンストレーションでは、4 mgのアセチルコエンザイムAを200 µLのランニングバッファーに溶解し、25 mMのストック溶液を作成しました。

このリガンドは、ITCサンプルの調製に使用するまで-78°Cで保存できます。まず、AAC 6' 1 Iの書面プロトコルに記載されている通り、C値が64になるように酵素濃度を算出します。これは192 µMの濃度に相当します。ろ過済みのランニングバッファーでストック溶液を希釈し、この濃度の高分子溶液を2 mL調製します。アセチルCoA溶液を氷水浴で解凍します。アセチルCoA溶液が解凍されたら、穏やかに混合します。高分子の濃度に結合部位数を掛け、さらに10を掛けて、リガンド溶液の濃度を算出します。

25 mMのアセチルCoAストック溶液80 µLを420 µLのランニングバッファーに加え、混合してアセチルCoA溶液を調製します。希釈したアセチルCoA溶液をピペット充填チューブに移し、残りの25 mMストック溶液は保管のため-78 °Cに戻します。AC6'1IおよびアセチルCoA溶液を、目的の実験動作温度より1 °C低い19 °Cで、真空下で5分間脱気します。

注入用シリンジをセットするには、シリンジホルダーにシリンジを挿入し、あらかじめ取り付けられているシリンジクランプがホルダーと同じ高さになるまで進めます。2つ目のシリンジクランプを注入用シリンジに被せ、シリンジホルダーの底部にしっかりと押し付けます。付属の0.05 inchボールポイント六角ドライバーを使用して、クランプを静かに締め付けます。

次に、シリンジホルダーをピペットホルダーに取り付けます。ピペットインジェクターを注入用シリンジにゆっくりとスライドさせ、プランジャーの先端がシリンジの穴に直接入っていることを確認してください。完全に挿入されたら、シリンジホルダーのロックカラーをピペットインジェクターにねじ込んで固定します。

A a C six prime one eyeタンパク質サンプル溶液をロードする前に、装置に付属のセル洗浄システムを使用して、サンプルセルを50 milliliters以上のランニングバッファーで洗浄してください。2.5 milliliterの長い針付きガラスシリンジを用いて吸引し、サンプルセルから残留バッファーを除去します。別の清潔で乾燥した長い針を使用して、脱気真空装置から溶液を除去してください。

2.5 mLシリンジを使用します。A a C six prime one eyeタンパク質サンプルを最低1.8 mL、慎重にシリンジに吸い取ります。気泡が入らないように注意してください。

シリンジにタンパク質試料を充填したら、サンプルセルに針を挿入し、セルの底に軽く触れさせます。針を約1 mm上げ、サンプルセルの上端に過剰な液体が見えるまで、試料をゆっくりとセル内に注入します。セル内に閉じ込められた気泡を排除するため、溶液がオーバーフロー部分に残っていることを確認しながら針を約1 cm上げ、約0.25 mLの溶液を素早く吸引して再び注入します。

次に、オーバーフローの側面に沿って、ニードルをゆっくりと上方にスライドさせます。サンプルウェル内でニードルが段差に当たります。この段差がランニング溶液の目的の高さを示すため、この段差より上の液体をすべて吸い出してください。

注入用シリンジに充填するため、プラスチックチューブ付きの充填用シリンジを充填ポートに取り付け、プランジャーの先端を充填ポートの上端まで下げます。次に、DGA配位子溶液が入ったピペット充填チューブをピペットホルダーの底に配置します。シリンジの先端が充填チューブの底に触れていないことを確認し、充填用シリンジのチューブに少量の溶液が入るまで、ゆっくりと溶液をシリンジ内に吸引します。

次に、プランジャータップを下げて充填ポートを閉じます。これは「充填ポートを閉じる」ボタンをクリックすることで行われます。その後、ロード中に混入した可能性のある気泡を除去します。

パージ・リフィルボタンをクリックして、パージとリフィルを行います。これを合計3回繰り返します。パージ・リフィル工程が完了したら、フィリングチューブをピペットホルダーから取り外し、シリンジのチップをラボ用ティッシュペーパーで静かに拭き取ります。

次に、ピペットアセンブリのシリンジをサンプルの中に下げます。針は曲がりやすいため、注意してゆっくりと進めてください。ロッキングカラーのベースを押し下げて、シリンジが完全に挿入されていることを確認します。

シリンジを固定した後、希望の動作温度を設定し、予想される最大注入熱流よりもわずかに高いリファレンスパワーを選択します。この例では、動作温度に20 °C、リファレンスパワーに20 µcal/sを使用しています。次に、希望の注入量と遅延時間をプログラミングします。

ここでは28回の注入を行い、1回目は2 µLの容量で62秒の遅延時間を設定し、それ以降の注入は10 µLの容量で332秒の遅延時間を設定します。ここで示す実験は、必要な追加曲線を生成するために、単一濃度でデータセットを作成するための基礎となります。高分子およびリガンドの濃度を下げながら、このプロセスを繰り返してください。

濃度による誤差を最小限に抑えるため、すべての高分子およびリガンド試料は同一のストックソリューションから調製してください。ここでは、192 µMのmicro molecule A A C six prime oneに対して3.86 mMのリガンドacetyl coenzyme Aを滴定して得られた、等温滴定カロリメトリー（ITC）の未処理データ（トレース）を示します。

2サイト逐次適合法を用いて結合パラメータを決定するため、眼の積分値を使用しました。このグラフは、さまざまな濃度のACE Coenzyme AおよびAAC C six Prime One Eyeを用いてITCにより生成された等温線を示しています。白抜きの円で表される実験データは、2セットの独立サイトモデルと2サイト逐次モデルの両方に適合させました。

2部位逐次モデルの方がより良好な一致が見られます。使用したタンパク質濃度は、付随する本文で定義されています。この手順を実施する際は、濃度の変化が結果に劇的な影響を及ぼす可能性があるため、希釈を非常に正確に行うことが重要です。