ティック腸内ライム病の病原体の迅速な伝達とローカリゼーションのための方法

この手順の全体的な目的は、Borrelia burgdorferi細胞をダニの腸内にマイクロインジェクションし、局在化させることです。まず、ガラスキャピラリー針を調製し、そこにB. burgdorferi細胞を満たします。次に、マイクロインジェクションによってB. burgdorferi細胞をダニの腸内へと移行させます。

次にダニを解剖し、腸組織を取り出します。最後に、ダニの腸におけるbeberg deferの免疫蛍光標識を行います。これにより、共焦点顕微鏡を用いて、ダニの腸内におけるbeberg to ferryの局在を示す結果を得ることができます。

こんにちは。メリーランド大学獣医学部の助教、Ruth Paul Paul博士です。本日は、私の研究室のメンバーであるポストドクターのToro Cairoと大学院生のAdam Colemanが、私たちが日常的に行っている微量注入によるダニの人工感染の手順について解説します。微量注入の後、ダニを解剖し、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いてダニの腸管内の細菌をイメージングします。

自然感染させたマダニの世代を生成することと比較して、マダニへのマイクロインジェクションの主な利点は、処置にかかる時間です。自然摂食プロセスで感染マダニを生成するには約5週間を要しますが、マイクロインジェクションはこの全工程を数時間に短縮します。この手法は、RNAi用の二本鎖RNAや、特定の抗体干渉用の抗血清など、他の有用な試薬をマダニ内部に注入するためにも応用可能です。

まず、ガラスマイクロピペットプラーを用いて、1 mmのガラスキャピラリーチューブを加熱・延伸し、マイクロインジェクション針を数本作製します。脆弱なキャピラリーチューブを慎重に取り除きます。作製した針は、先端を上に向けて、シャーレ内の粘着テープの上にまとめて保管します。

次に、B. berg de ferryをBSK培地で培養します。濃度が約10⁷ cells/mLになるよう、3000 ×gで10分間遠心分離してB. berg de ferryをペレット化します。室温で上清を除去し、200 µLの滅菌マイクロチップで穏やかにピペッティングしてペレットをBSK培地に完全に再懸濁し、最終濃度を10⁹ cells/mLに調整します。

細胞を高密度で再懸濁しているため、細胞同士が凝集する可能性があります。そのため、細胞懸濁液は直ちにマイクロインジェクションに使用してください。ダニを準備するには、粘着マットの上でガラススライドに透明な両面テープを貼り、容器からダニを慎重に取り出します。小さなブラシを使用して、注入に必要な数のダニを、腹側を上にして同じ方向に向くように両面テープの上に配置します。プールされたキャピラリーニードルに、beberg de ferry培養液を5 µL充填します。20 µLのマイクロロードピペットチップを使用して、ニードル内に気泡が混入していないかを確認し、必要に応じて細菌培養液を再充填してください。

必要に応じて、解剖用実体顕微鏡でマダニを観察し、マダニの肛門孔付近に焦点を合わせます。キャピラリーニードルの先端を軽く叩き、管径がマダニの肛門孔よりもわずかに小さくなるように管を破断させ、微量注入用ニードルを作成します。不適切なニードル先端でマダニに注入を試みると、損傷を与え死に至らしめる可能性があるため、この工程は極めて重要です。

注射済みのダニについて。固定したダニを実体顕微鏡下に置き、2枚の可動式肛門板で覆われている肛門孔に焦点を合わせます。微細ピンセットを用いて、肛門孔付近の任意の領域に軽く触れ、ごくわずかな圧力を加えます。

これにより、肛門板が分離され、腸へとつながる肛門孔が開きます。肛門板を強制的に開いた状態で、針先を肛門開口部に慎重にわずかだけ挿入します。ガラス製の針先が直腸につながる半透明の後腸を傷つける可能性があるため、針の挿入は最小限に留めてください。

自動フットコントロール付きマイクロインジェクターを使用し、以下のパラメータでベルグ・ド・フェリー溶液を注入します。注入圧 1000 Hector Pascals、注入時間 0.2 seconds、補正圧 8 Hector Pascal's。マイクロインジェクション後、各組織に1回ずつ注入を行います。

マダニは、注射前と同様に、刺激に対して動きを見せるか、または這い回るはずです。免疫蛍光顕微鏡観察のためにマダニを解剖するには、まず解剖用の清潔なガラススライドにリン酸緩衝生理食塩水の液滴を1滴、ポリLリシンコーティングされたスライドにさらに1滴置きます。顕微鏡観察用に、両面テープを貼った別のガラススライドを用意します。次に、容器からマダニを取り出し、両面テープの上に置きます。

解剖顕微鏡でダニに焦点を合わせ、小さなブラシを用いて位置を調整します。ダニの第1脚と第2脚の間に鋭利なカミソリの刃を置きます。強く押し下げてダニを2つに切り分け、腹部を露出させた後、細いピンセットを用いて直ちに腹部をPBSの一滴の中に浸します。切断部位の周囲の背側および腹側の外骨格を掴みます。

背甲を慎重に上に持ち上げてダニから引き離し、茶褐色の腸憩室を露出させます。解剖中のダニが常にPBSに浸かっているように注意してください。半透明の唾液腺束は腸の前部の両側に位置しており、必要であればこの時点で除去することができます。

ピンセットで残りの外骨格を固定し、腹部から腸を注意深く引き出します。気管などの挟まった組織を取り除き、腸を丁寧に洗浄します。細いピンセットの先を用い、ダニの腸を速やかにポリLリジンコートガラススライド上のPBS液滴に転送します。

細いブレードを使用するか、精密ピンセットの先端で軽く押すことで、腸管を小さく断片化します。腸管組織周囲の余分なPBSを注意深く吸引します。腸管組織を室温で風乾させます。

ダニの腸管をアセトンに10分間浸して固定します。室温で自然乾燥させてください。この段階で、スライドは密閉容器に入れ-20 °Cで数ヶ月間保存することが可能です。腸管の免疫蛍光標識を行うには、固定したダニの腸管の周囲をPAPペンまたはその他の疎水性バリア形成剤で囲みます。

これにより、その後のインキュベーション工程において染色液を保持させることができます。ダニの腸にブロッキングバッファーを1滴または数滴滴下し、室温で30分間静置します。

ブロッキングに使用する血清は、抗体の宿主動物の種類によって異なります。ここから先、スライドが乾燥しないようにしてください。ブロッキングバッファーをゆっくりと吸引します。

腸管を適切な一次抗体および／または二次抗体溶液でインキュベートします。本手順では、フルオレセイン・イソチオシアネート（FITC）標識抗B. berg抗体を使用します。ブロッキングバッファーで100倍に希釈した抗体を、1時間作用させます。

室温にて、光への曝露を制限するために容器をアルミホイルで覆います。抗体溶液を穏やかな吸引によって除去します。DPIやプロピジウムヨードなどの蛍光染料を用いて、マダニ組織を標識するために腸管をインキュベートします。

通常、20 µg/mLのヨウ化プロピジウムを含むPBSを用い、室温で5分間処理した後、0.05% Tween 20含有PBSで5分間、3回洗浄します。最後に、抗退色剤を含む緩衝グリセロールでスライドを封入し、カバーガラスで慎重に覆います。スライドは、この段階で密閉容器に入れ、4 °Cで数ヶ月間保存することが可能です。その後、共焦点顕微鏡を用いて画像を撮影し、局在を確認します。

ここでは、視認性を高めるためにクマシブリリアントブルーを満たした針を用いたダニへの微量注入を示しています。微細ピンセットを用いて体に緩やかな圧力をかけることで、肛門板を分離させ、微量注入のための肛門孔を開かせることができます。ここでは、腸管内にbeberg ferryが含まれた腸憩室の前部領域を示しています。

腸核とスピロヘタは、それぞれプロピジウムヨードまたはfitzy結合抗beberg ferryで標識されます。習熟後、10匹のマダニに、自然状態で10万個の生存個体を含むferをマイクロインジェクションすることが可能であることがわかりました。マダニはすぐに他の実験に使用できますが、通常は処置後の生存を確認するため、1～2日待ってから次へ進みます。

このビデオを視聴することで、共焦点免疫蛍光染色の結果を用いて、マイクロおよび局所的なバリアバグをダニの腸内に導入し、人工感染ダニを作製する方法について深く理解できるはずです。ダニおよび Borrelia burgdorferi などのヒト病原体を充填した微細ガラス針を扱う作業には危険が伴います。ダニと針の位置に常に注意を払い、常にバイオセーフティーレベル2の予防措置を講じてください。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。