ELISAによるネイティブ無傷ヌクレオソーム上の翻訳後修飾の検出

この手順の全体的な目的は、100万個の細胞から得られた全細胞ヌクレオソーム調製物における翻訳後修飾の相対的レベルを正確に定量することです。これは、まず哺乳類細胞の高品位で均質な培養物を調製し、次いでダウンス型ホモジナイザーを用いた機械的破砕と遠心分離によって、細胞から核を単離することで達成されます。

次のステップは、核内に存在するクロマチンを消化し、一連の低張抽出を行うことで、無傷のヌクレオソームを得ることです。最後に、適切なコントロールを用いたELISAアッセイでヌクレオソームを解析し、特定の翻訳後修飾を同定します。最終的に、ヌクレオソームサンプル内に存在する特定の修飾の相対レベルを示す結果を得ることができます。

ウェスタンブロッティングやクロマチン免疫沈降などの既存の手法と比較して、本手法の主な利点は、多くのヌクレオソーム修飾状態の全体像を容易に把握できる点にあります。本手法はウェスタンブロッティングよりもはるかに感度と精度が高く、一般的な分子生物学実験の設備が整ったほとんどの研究室で実施可能です。本手法は、主要な分化やリプログラミングイベントが発生した際に何が起こるかなど、幹細胞およびエピジェネティクス分野における重要な疑問への回答に寄与します。

手順を開始するには、まず15 cmプレートあたり3 mLのトリプシンを用いて細胞をトリプシン処理し、新鮮なトリプシン化細胞を調製します。氷冷したPBS butyrateを20 mL加えます。細胞を50 mLコニカルチューブに移し、1000 RPMで5分間遠心分離して細胞を回収し、上清を吸引して、洗浄のために氷冷したPBS butyrateを10 mL加えます。細胞懸濁液を再度1000 RPMで5分間遠心分離します。

上清を除去し、書面によるプロトコルに従い、プロテアーゼ阻害剤を含むライシスバッファー 4 mL で細胞ペレットを再懸濁します。次に、細胞を氷上の A type B pestle down homogenizer にピペットで移し、20回ストロークしてホモジナイズします。その後、ホモジネートを氷上の遠心チューブに移します。

サンプルを2000 Gで10分間、4 °Cで遠心分離します。細胞質成分を含む上清を取り除き、再懸濁します。

ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を含む氷冷した2 mLの洗浄バッファーCに懸濁させ、再懸濁した物質を、冷やした遠心チューブ内の5 mLの30%スクロースクッションの上に静かに重ねます。核を単離するため、スイングバケットローターを用いて2,400 Gで5分間遠心分離します。核はクッションを通過して移動し、細胞のデブリは界面に留まります。遠心分離後、すべての液体を注意深く取り除き、核をプロテアーゼ阻害剤を含む氷冷した250 µLの洗浄バッファーCで再懸濁し、1.5 mLのマイクロ遠心チューブに移します。

ヌクレオソームの単離を開始するため、核に0.1 molarの塩化カルシウムを3 µL加え、温度が安定するまで37 °Cのヒートブロックに置きます。次に、micro cocal nucleaseバッファーに溶解した2 unitsのmicro cocal nuclease（10 µL）を加え、37 °Cで12分間インキュベートします。ピペットチップを用いて頻繁に混合してください。

インキュベーション後、0.5 M sodium EDTA pH 8 を 6 µL 加えて反応を停止させ、氷上に置いて冷却します。次に、サンプルを 2000 ×g で 4 分間遠心分離します。遠心分離後、上清を捨ててペレットを再懸濁させます。0.2 mM sodium EDTA 300 µL 中で、時々穏やかにピペッティングして混ぜながら、サンプルを氷上で 1 時間インキュベートします。

4°Cで3000 Gにて4分間遠心分離した後、遊離ヌクレオソームを含む上清を新しい遠心チューブに回収し、追加のヌクレオソーム回収に備えて氷上で保存します。ペレットを、前述と同様に300 µLの0.2 mM EDTA溶液に懸濁し、時折穏やかに混合しながら、氷上で1時間インキュベートします。

インキュベーション後、サンプルを遠心分離します。得られた上清を、マイクロ遠心チューブ内の残りのサンプルと合わせて氷上に置きます。ヌクレオソームELISAアッセイを開始するために、96ウェルELISAプレートに、ヌクレオソームとコーティングバッファーを用いて、最上段のウェルを0.1 µg/50 µLとして5段階の2倍連続希釈系列を分注します。すべての希釈系列は3連（triplicate）で分注してください。

コントロールとして、コーティングバッファーのみを入れたウェルを含めることを忘れないでください。プレートを4°Cで一晩インキュベートし、翌日に処理を行います。プレートウォッシャーを使用し、室温で、1ウェルあたり200 µLの0.5% Tween 20含有PBSで4回洗浄します（合計10分間）。

次に、ブロッキング溶液を1ウェルあたり100 µLずつ加え、室温のローテーターで1時間インキュベートします。インキュベーション後、プレートを逆さまにしてシンクの上で激しく振ることで、ブロッキングバッファーを除去します。続いて、PBSに0.05% Tween 20および5% PSAを含む溶液で希釈した一次抗体を、1ウェルあたり50 µLの容量で加え、室温のローテーターで1時間インキュベートします。

一次抗体反応後、プレートウォッシャーを用いて前述と同様にプレートを洗浄します。洗浄手順が完了したら、5% BS, A および 0.5%20 を含む PBS で希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ接合二次抗体を、1ウェルあたり 50 µL ずつ添加し、ローテーターを用いて室温で1時間インキュベートします。二次抗体反応後、前述と同様にプレートを洗浄します。

プレートウォッシャーを使用してプレートを処理します。各ウェルに50 µLのTMB ELISA基質を加え、室温で10分間インキュベートします。ELISAプレートのウェルが青色に変化し、その色の強さは各ウェルに含まれるヌクレオソーム修飾量に比例します。

次に、各ウェルに2 N 硫酸を 50 µL 添加して反応を停止させます。色は茶色に変化します。プレートを 1500 RPM で 2 分間遠心分離し、気泡を除去してください。

これでプレートをコロリメトリックプレートリーダーで定量分析する準備が整いました。最後に、450 nanometersでプレートを測定し、解析のために結果をエクスポートします。この手法に習熟し、適切に実施できれば、開発後は2日間で完了させることができます。

この技術により、幹細胞研究分野の研究者が、エピプロテオーム全体のレベルで分化およびリプログラミングイベントに対するエピジェネティックな応答を探索することが可能になりました。