ニューロン相馬と軸索のコンパートメントのためのマイクロ流体デバイスの作製

Newly John博士の研究室へようこそ。John研究室では、生物学的応用のためのマイクロ流体プラットフォームのエンジニアリングを専門としています。このビデオでは、一次ニューロンの区画化および培養のために設計されたマイクロ流体デバイスの作製と活用方法について解説します。

ニューロンデバイスは、2005年8月にNature Methodsで初めて発表されました。導入以来、このニューロンデバイスは世界中の共同研究者によって広く利用されています。ニューロンデバイスは、フォトリソグラフィーによって作製されたデバイスのSUAパターンを含むシリコンウェハー上で成形されたPDMS片で構成されています。

このデバイスは、直径8 mmの4つのリザーバー、幅1.5 mm、長さ7 mm、高さ100 µmの2つのメインチャネル、および2つのメインチャネルを接続する幅10 µm、高さ3 µmのマイクログルーブという3つの主要な特徴を備えています。マイクログルーブの長さは150 µmから900 µmまで変更可能ですが、標準的な選択長は450 µmです。メインチャネルとマイクログルーブが垂直になるようにデバイスを観察すると、グルーブの左側にあるリザーバー同士がメインチャネルを介して接続されており、右側のリザーバー同士も同様に接続されていることがわかります。

この機能により、液体をメインチャネルに流すことができ、細胞のロードや培地の交換を可能にする重要な役割を果たします。ニューロンデバイスには、従来の組織培養プラットフォームと比較して3つの大きな利点があります。1つ目は、細胞体（soma）と軸索を区画化できることです。ニューロンデバイスを用いることで、純粋な軸索画分を得ることが可能になります。

マイクログルーブのサイズと長さにより、軸索をもう一方のメインチャネルへ通過させつつ、細胞体が乗り越えるのを防ぐことができます。2点目に、デバイスの設計と静水圧を利用することで、デバイスの一方のリザーバーの液量をもう一方より高く維持するだけで、細胞側または軸索側のいずれか、あるいはその両方を個別に処理することが可能です。そして3点目に、デバイスの軸索のみが含まれる画分を真空吸引で切断できるため、研究者は軸索の再生を研究および観察することができます。

研究者のHina Leeが、マイクロ流体ニューロンデバイスの作製手順を実演します。フォトリソグラフィーによってSU-8でパターン形成された3 Angのシリコンウェハを使用して、ポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロ流体モールドを鋳造します。このSU-8パターンシリコンウェハをマスターモールド、または単にマスターと呼びます。

PDMSを硬化剤と10:1の重量比で混合します。例えば、PDMS 15 gに対して硬化剤 1.5 gを用います。その後、PDMSを十分に混合し、シリコンウェハー上に流し込みます。

シリコンウェハは10 centimeterのポリスチレン製ペトリ皿に入れています。MAを約four millimeterの厚さで覆うには、約12 gramsから15 gramsのPDMSが必要です。次に、PDMSを塗布したマスターをペトリ皿の蓋を開けた状態で真空デシケーターに入れ、真空引きを行います。

これは、硬化剤の攪拌中にPDMS内に混入した気泡を除去するために行います。気泡が除去されるまでには約15分かかります。真空デシケーター内で15分経過後、PDMSを塗布したマスターをデシケーターから取り出します。

PDMSマスターにまだいくつかの気泡が残っています。0.45 micronフィルターを備えたエアガンを使用して、残っている気泡を除去します。その後、マスターを80 °Cのホットプレートに1時間置いてキュアさせます。

真空デシケーターが利用できない場合は、マスターを室温で数時間放置してください。気泡は最終的に自然に消滅します。ホットプレートが利用できない場合は、PDMSは24時間後に室温で硬化します。

硬化プロセス中、マスターが水平であることを確認することが重要です。PDMSがマスター上で硬化した後、外科用メスを用いてクリーンフードへ移動させます。デバイスの周囲に沿って円形に切り込みを入れます。

ブレードをPDMSに挿入してシリコンウェハーに接触させることが重要ですが、ウェハーに過剰な圧力をかけないようにしてください。さもなければ、デバイスの周囲に円状の切り込みが入り、マスターが割れてしまいます。3インチのシリコンマスター1枚につき、4つのデバイスがあります。PDMSをマスターから慎重に剥離させます。

外科用メスを、あらかじめ入れた切り込みに挿入しながら、ゆっくりとひねることで開始できます。モールド上のPDMSデバイスは非常に薄くなっています。8 mmの組織生検パンチを用いて、デバイスに上向きのリザーバーを開けます。

パンチャーに残った破片をロッドで押し出します。次に、デバイスを4等分し、Corning社製のカバーガラス（No.1、24 mm × 40 mm）に適切に収まるように余分なPDMSをトリミングします。窒素ガスを用いて、残った破片を吹き飛ばして除去します。

しつこいゴミは、3M スコッチブランド 4 7 1 ビニールテープを使用して除去することも可能です。これで、洗浄済みのデバイスをプラズマボンディングに使用できる状態にします。Herrick プラズマクリーナーを用いて、ニューロンデバイスをカバーガラスに短時間でボンディングします。

デバイスとカバーガラスをトレイに載せ、そのトレイをプラズマクリーナーに入れ、真空ポンプを用いてチャンバー内から空気を排気します。PDMSデバイスは、デザイン面がプラズマガスにさらされるよう、上向きに配置することが重要です。

真空度が300 millitorrに達した後、電熱コイルに電源を入れ、「高」に設定します。チャンバー内に少量の空気を取り入れてプラズマ発生を促進させるため、ドアをわずかに開けます。その後、デバイスとカバーガラスを2分間プラズマ処理します。

チャンバー内の紫色の光に注目してください。これが実際のプラズマです。電気コイルによってプラズマが生成されます。プラズマとは、電子、イオン、および中性の原子または分子からなる部分的にイオン化されたガスのことです。

プラズマはガラスとデバイスの表面に反応性種を生成し、これらを接合させることで恒久的な結合が形成されます。また、プラズマは表面を親水性に変化させ、液体の添加を容易にします。さらに、プラズマクリーナーによってデバイスの滅菌も行われます。

2分間のプラズマ処理後、真空装置の電源を切り、チャンバー内に空気を導入します。プラズマ処理を施したガラス面とマイクロ流体デバイスの表面を、クリーンベンチ内で互いに接触させて組み立てます。その後、デバイスを滅菌済みの60 mmディッシュに入れます。

プラズマ処理を施したガラスとデバイスの表面は、強固で不可逆的な結合を形成します。プラズマボンディング後10分以内に、デバイスをガラスに固定し、デバイスにポリリシンを添加します。10分後には、デバイスの親水性が低下します。

これにより、PLLがデバイス内に浸入しにくくなります。PLL添加後は、デバイス内に気泡がないか確認することが重要です。気泡を除去する簡単な方法として、100 µLの液体を満たしたP 200ピペットを使用する方法があります。

このケースでは、PLLのチップをメインチャネルの開口部に直接配置し、P 200を強く押し下げます。この操作を数回繰り返す必要があるかもしれませんが、最終的にはピペットによる圧力で気泡が押し出されます。PLLを含むデバイスを、37°C、5% CO2の標準的な組織培養インキュベーターで一晩インキュベートします。

PLLで24時間インキュベートした後、デバイスをオートクレーブ済みの脱イオン水で素早く2回洗浄します。この工程において、メインチャネル内の液体は決して完全に除去せず、リザーバー内の液体のみを除去してください。メインチャネルから液体を除去すると、気泡が混入します。

2回素早くすすいだ後、デバイスに再びオートクレーブ滅菌済みの脱イオン水を満たし、インキュベーターで最低3時間または一晩置きます。翌日、水で一晩または最低3時間インキュベートした後、デバイスを再びバイオセーフティキャビネットに入れ、脱イオン水で2回すすぎます。その後、一次ラットニューロンの培養に必要なサプリメントであるB 27およびグルタミン酸を含むニューラル基礎培地をデバイスに添加します。

その後、デバイスをインキュベーターに戻し、次回の使用に備えます。これで、ニューロンを播種するための準備が整いました。本ビデオでは、ニューロンデバイスの作製に使用したソフトリソグラフィーの技術について実演しました。

これらのデバイスは、ニューロンやその他の目的の細胞タイプの培養に使用できます。これらのデバイスの最大の利点は、デバイスの一方でニューロン細胞体を、もう一方では純粋な軸索画分を、分離して区画化した状態で培養できることです。次のビデオでは、E 18ラット胎児皮質ニューロンの調製方法と、デバイスへの細胞の播種方法について説明します。

John研究室からの解説は以上です。ご視聴ありがとうございました。