エンハンサートラップフリッパーゼの幼虫における発現と成人のマッピングとその応用ショウジョウバエ CNS

本実験の全体的な目的は、組織特異的リパーゼとGAL80変換ツールを用いて、GAL4発現を精緻化することである。これは、一連のenhancer trap Philippe（ET-Flip）トランスジェニックショウジョウバエ系統を作製し、各系統におけるリパーゼの中枢神経系（CNS）発現パターンを決定することで達成される。GFPレポーターを用いた免疫化学的分析およびGFPレポートを用いることで、グリア細胞由来の発現と神経細胞由来の発現を区別でき、目的のET-Flip系統においてGAL4発現を交差させることが可能となる。これは、子代においてGAL80変換ツールを含む個体を用いることで行われる。

クローナル解析は、眼などの組織におけるGAL4発現の精緻化を解析するために利用できます。既存の手法に対する本手法の主な利点は、エンハンサートラップ系統をGAL80変換ツールと組み合わせることで、ショウジョウバエのコミュニティですでに利用可能となっている膨大なGAL4ライブラリを迅速に活用できることです。さらに、この概念はゼブラフィッシュなどの他のGAL4 UAS発現モデル生物にも展開することが可能です。

この手法は、行動の基盤となる神経回路のマッピングにおける重要な疑問を解決するのに役立ちます。本プロトコルでは光受容体細胞のサブセットにおけるflipベースの使用を実演していますが、このインターセクショナル法は、非神経組織を含む他の組織の解析にも適用可能です。今後、さらに多くのエンハンサートラップリパーゼ系統が特性評価されることで、活用の幅が広がると期待されます。

GAL4-US系は、ショウジョウバエ生物学において広く用いられている重要な手法です。多くのGAL4系統における注意点として、その発現範囲が広すぎるため、FLIP-out法を用いた脳の行動マッピングに使用するには不十分な場合があります。ET-FLPトランスジェニックを用いてGAL4発現系統の発現を部分的に制限する前には、目的の細胞種においてGAL4の発現を微調整することは不可能です。

まず、中枢神経系（CNS）におけるflip aの発現を可視化するために、発生後半期の幼虫および成虫におけるET flip x twoトランスジェンの発現パターンを把握することが有用です。目的のET t flip X twoトランスジェンを持つ雄と、et flip発現用のGFPレポーターを持つ処女雌を交配させます。解剖用に、徘徊期のF1第3 instar幼虫を回収します。幼虫を清潔なS guardディッシュに移し、絵筆でゴミを取り除いた後、1×PBSでディッシュを1回洗浄します。

次に、ディッシュに氷冷した1×PBSを満たし、幼虫を麻酔させます。幼虫のCNSにアクセスするため、ピンセットでマウスフックを固定します。前方球状部の延長部分付近のクチクラを掴み、剥がします。これにより、CNSが他の構造とともにマウスフックに付着したまま残ります。

次に、ピンセットを用いて、CNSを解剖しながらその周囲にある余分な組織をすべて取り除きます。取り除いた組織は、PBSを満たした3ウェルのPyrexディッシュに個別に移してください。すべてのCNSの解剖が完了したら、氷上で200 µLの4% PFAに完全に浸し、固定します。

CNSが浮いている場合は、周囲の組織が完全に除去されていません。その場合は、ピンセットを用いてCNSを再び固定液に浸し、15分間固定した後、氷冷PB Sで組織を3回洗浄し、さらに氷冷PBTで3回洗浄してください。これで、組織をイメージングまたは抗体でラベルする準備が整ったことになります。また、後で使用するために4°CのPBTで保存することも可能です。

幼虫を採取した際と同じ交配群から、解剖前にF1成虫を収集します。5〜10匹のハエを、冷却した95%エタノールに30秒間浸し、クチクルの表面にあるワックスを除去します。エタノールを取り除くため、成虫を氷冷1×PBSで3回洗浄し、3回目の洗浄後、解剖の準備として成虫1匹を氷冷1×PBSを満たした35mmのシルガードディッシュに移します。

腹側を上にして置き、腹部の中央にミニオンピンを刺します。まず、ピンセットを用いて脚を取り除き、解剖を開始します。次に、頭部をプロップで固定しながら、目の下から頭頂部に向かって頭部のクチクラを剥がして除去します。

鋭利なピンセットを用いて、脳周囲の気管組織を慎重に取り除いてください。気管組織は強い自家蛍光を持つため、固定中に脳を浮遊させてしまう原因となります。成虫の中枢神経系（CNS）は脳だけではなく、胸部にある腹側神経索（VNC）も含まれるため、こちらも同様に解剖する必要があります。

まず、後脚の付け根でハエを固定し、胸部の角皮を首の付け根までゆっくりと剥がして除去します。次に、VNCを露出させるため、胸部角皮の両端をゆっくりと広げます。さらに、第2脚の付け根で固定し、第1腹節付近から腹部を牽引して、胸部から腹部を取り除きます。

第四に、肩甲領域で固定し、VNC周囲の組織を慎重に剥離してVNCを洗浄します。頸部結合組織を囲む結合組織のリングを引き裂き、脳を回収しながら余分な組織の除去を続けます。その後、VNCをペアとして、氷上で冷却した1×PBSを満たした9ウェルのPyrexディッシュに転移させます。

成体組織を固定するため、氷上の4% PFAに15分間浸漬させます。その後、氷冷したPBSで3回洗浄し、続いてPBTで3回洗浄します。これで、導入遺伝子の発現を高精度に解析するためのイメージングまたは抗体による標識が可能な状態になります。

基準となる枠組みを提供するために、中枢神経系（CNS）をニューロンまたはグリアマーカーで標識することが有用です。まず、組織をニューロンまたはグリアに対する抗体とともに4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、調製物をPBTで5回洗浄し、蛍光二次抗体とともに室温で2時間インキュベートします。インキュベーション終了後、抗体の光退色を防ぐためにプレートをホイルで包みます。

調製物をPBSで洗浄し、スライドガラスにホールマウントします。カバーガラスで組織が押し潰されないよう、OSHAプラスチックリングを使用してください。これで、蛍光顕微鏡下でGFPおよびLLの発現パターンを確認する準備が整いました。

通常、flipの発現パターンの再現性を確認するために、3〜5つのレプリケートを検討します。flip, a系統におけるflipの発現パターンは、他のトランスジェンと共に用いることで、GAL4リプレッサーであるGAL80の発現様式を変化させることができます。GAL80リプレッサーの発現を変化させることは、変更を加えるための有効な方法です。

GAL4発現において、ある手法は、眼全体で眼の変性を誘導しているGAL4を不活性化する導入遺伝子GAL80の発現をフリップアウト（除去）させることです。ここではETフリップ系統hash 6 88 Aを用い、F1世代の光受容細胞の一部におけるGAL80変換ツールの有効性を評価し、その眼の表現型を親系統の眼の表現型と比較します。眼の変形や脱色素が見られれば、フリップの発現パターンが光受容細胞に存在し、GAL80のフリップアウトが成功したことが確認されます。

相補的で非冗長な戦略として、同じ目的のflipラインを用いてGAL 80発現をフリップインさせることが挙げられます。この戦略はもう一方の手法と非常に似ていますが、この場合はF1子代におけるIDの色素沈着と変性が抑制されます。flip X twoにおいて。

光受容体の発現。CNSの解剖に習熟すれば、適切に行った場合に、成虫では約5分、幼虫では1分で完了させることができます。この操作を行う際は、鋭いピンセットを使用して、成虫およびLibre CとSsの両方から気管と周囲の組織を除去することが重要です。解剖には、固定剤を含まないディッシュを使用してください。現在は、ランダムクローンを生成するために、ヒートショックFLIP法が用いられています。

対照的に、enhancer trap flipは再現性のあるクローンを生成することを可能にし、形態学的および行動学的解析を容易にします。finger法のもう一つの利点は、追加のanan trap flipベースの系統や他のgal系統を用いることで、GAL4の発現パターンをさらに制限できることです。tubulin stop GAL80構成の弱点は、GAL4とUASエフェクター（LAG4やU-A-S-K-I-Rなど）の特定の組み合わせが、ショウジョウバエを死に至らしめるため互換性がないことです。

この問題は、UAS Shiri Tsのような条件付きUASエフェクターを使用することで容易に克服でき、これにより制限温度下で行動を解析することが可能になります。予想通り、すべてのエンハンサートラップリパーゼ系統が、有用なレベルまで十分にリパーゼを発現するわけではありません。それでも、ここで述べるフィンガーテクニックは、発生回路または行動のいずれかに対するモザイク解析を洗練させるための、ショウジョウバエ研究者にとっての新しいアプローチを提供します。