心原性誘導効率を定量化するために修飾されたマウス胚性幹細胞ベースのアッセイ

本実験の全体的な目的は、マウス胚性幹細胞の心筋細胞分化に必要な重要な時間的制御を特定することである。この目的を達成するため、まず96ウェル丸底プレートを用いて胚様体（EB）を形成し、第2ステップとしてEB形成を標準化する。その後、あらかじめ設定したタイムコースに従ってタンパク質または化学修飾因子をEBに添加し、検討対象となる経路の時間的制御を行う。

次に、さまざまな信号変調スキームの誘導効率を決定するため、拍動するEBSを手动で定量します。拍動するEBSの形成率およびハンギングドロップ法による確認に基づき、心筋細胞分化における必須シグナル伝達経路の時間的要件を示す結果が得られます。ハンギングドロップ法のような既存の手法に対するこの技術の主な利点は、労力のかかる手順を標準化および簡略化し、定量のための直接的な読み取りを可能にすることです。

この手法は、目的の細胞型への分化を誘導する必須のシグナル伝達経路の特定など、幹細胞生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手順を開始するには、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor）を添加したマウスES細胞培地を用い、10 centimeterの細胞培養プレートでマウス胚性幹細胞（ES細胞）を培養します。ES細胞が50〜70%のコンフルエンスに達した時点で、使用可能な状態となります。

ES培地を除去し、5 mLの滅菌PBSで細胞を1回洗浄します。各プレートに0.05% trypsin EDTAを2 mL加え、37 °Cで3〜5分間インキュベートします。次に、1プレートあたり3 mLのES培地を加えてtrypsin EDTAを失活させ、細胞を50 mL遠心チューブに移します。

1000 rpmで3分間遠心分離します。遠心後、上清を除去し、任意の量のEB培地で細胞ペレットを再懸濁します。細胞数を計測し、細胞密度を5×10³ cells/mLに希釈します。

マルチチャンネルピペットを用い、細胞を含むEB培地100 µLを96穴丸底マイクロタイタープレートの各ウェルに分注します。必要な96穴プレートの枚数は、実験の条件数およびタイムポイントによって異なります。心臓形成における主要なシグナル伝達経路の重要な時間窓を特定するため、96穴丸底マイクロタイタープレートを、加湿された37 °C、5% CO2インキュベーター内に設置します。

特定のシグナル伝達経路のモジュレーターをES細胞に添加します。96ウェル丸底プレートの各ウェルに、培地で希釈したシグナル伝達モジュレーターを様々なタイムポイントで添加します。各96ウェルプレートのウェルの半分を、各処理開始タイムポイントに使用します。

各タイムポイントにおいて、残りの48ウェルにビークルコントロールを添加します。異なる停止時点において、培地を交換することで各ウェルからシグナル伝達調節剤を洗い流しますが、その際、胚体（EB）を乱さないよう細心の注意を払う必要があります。異なる停止時点において、ウェルのEB培地を交換し、調節剤を洗い流します。96ウェルプレートを約10度の角度に傾け、マルチチャンネルピペットでウェルから培地を静かに除去します。

その後、48時間を超える処置を行う場合は、各ウェルにモジュレーターを含まないEB培地を補充します。目的の停止時間まで、2日ごとに新鮮なモジュレーターを添加したEB培地へと交換してください。ES細胞を96ウェルプレートに移してEBSを誘導してから7日後に、顕微鏡下でEBの収縮を確認します。

各治療時間経過における収縮EBSの割合を算出するため、収縮しているEBSが含まれるウェルを陽性と判定します。96ウェルプレートを用いた実験で特定された心筋形成のシグナリングの時間窓は、吊り下げ滴法で作製したEBS（吊り下げEB滴）を用いて検証することが可能です。まず、後の液滴の変形を防ぐため、ペトリ皿に3〜4 mLのPBSを加えて準備します。

次に、最終密度 2.5 × 10⁴ cells/mL で調製した ES 細胞懸濁液を、取り出しやすいようにバクテリアディッシュに移します。マルチチャンネルピペットを使用し、ペトリ皿の裏返した蓋の上に ES 細胞を 20 µL ずつ滴下します。このとき、個々の液滴同士が接触しないようにしてください。

一般的に、1枚の蓋に最大80滴まで配置できます。その後、蓋をPBSを含むペトリ皿の上に伏せて、37 °C、5% carbon dioxide インキュベーター内で48時間培養し、EBを形成させます。48時間後、各蓋から吊り下げられた液滴で形成されたEBを、3 mLのEB培地で洗い流します。

2つのEBSの蓋を新しいペトリ皿に移します。このペトリ皿を37 °C、5% carbon dioxideインキュベーターで4日間培養します。4日目に、浮遊状態のEBSを一般的に0.2% Gelatinコートされた6ウェルプレートへ移します。各ウェルに30個のEBSを移し、96ウェルプレートの実験で特定された期間にシグナル伝達調節剤を添加して培養します。これはハンギングドロップ法による作製から7日後になります。

顕微鏡下でEBを観察し、EBの収縮を確認します。96ウェルプレートのラウンドボトムウェルで培養したES細胞は、4日目に形成されたEBの代表的な画像に示すように、EBを形成します。ES細胞からの心筋分化におけるクリティカルタイムポイントとは、ビークルコントロールと比較して、シグナル調節剤で処理した際に収縮するEBの割合が最も高くなる時間窓のことです。ここでは、96ウェルマイクロタイタープレート上で分化10日目の、ドルサルモルヒネ処理したES細胞から形成された自発的に収縮する心筋細胞のフォーカスを示しています。

このビデオを視聴することで、ES細胞の心筋分化における主要なシグナル伝達経路の重要な時間的制御およびウィンドウを効率的に特定する方法について、十分に理解することができます。