環境試料中の有機Pのハイスループット測定と分類

本手順の目的は、土壌または堆肥サンプルの抽出液に含まれる酵素加水分解性有機リンを分類することです。まず、水酸化ナトリウムEDTA溶液でサンプルを抽出し、抽出液のpHを調整します。次に、これらの調整済み抽出液を2種類の異なる酵素溶液とともにインキュベートします。

96ウェルプレートを用いた最終ステップとして、モリブデンブルー比色法により酵素で放出された正リン酸を測定します。最終的に、酵素加水分解法による正リン酸の放出量の差に基づいて、土壌または堆肥試料中のほとんどの天然正リン酸モノエステルリンおよびジエステルリン形態を分類することが可能です。この手法は、あらゆる標準的な研究室で低コストに実施できます。

リン31核磁気共鳴分光法などの既存の手法と比較した主な利点は、土壌中の天然酵素が、将来的に有機エンドウ豆化合物から正リン酸を放出させる能力を測定できる点にあります。したがって、この手法で得られたデータは、土壌肥沃度の予測や、藻類が利用可能な正リン酸が有害な量で放出される可能性の予測に役立ちます。50 mLのコニカルチューブに入れた2 gの湿潤または乾燥試料に、0.25 Mの水酸化ナトリウム溶液を30 mL加えます。

室温で16時間、攪拌しながらインキュベートします。サンプルを3000 ×gで30分間遠心分離し、その後、あらかじめ酢酸緩衝液を入れた1.5 mLマイクロ遠心チューブに100 µLを移します。調整後のサンプルの全量は1 mLとなり、pHは5.0になります。

新鮮に調製した0.1 M 酢酸ナトリウム（pH 5）10 mLに、酸ホスファターゼを0.5 units/mLの濃度で含むストック溶液を2本準備します。次に、酸ホスファターゼストック溶液の10 mLチューブの1本に、再構成したPenicillium Citron由来の凍結乾燥ヌクレアーゼNP1を加え、最終濃度が2.5 units NP1/mLとなるようにし、数回反転させて穏やかに混合します。これら2つの酵素溶液を3000 ×gで30分間遠心分離します。検量線を作成するために、まず1.5 mL遠心チューブに1 mM 濃度のリン酸カリウムストック溶液を1 mL加え、0.5 mLずつの連続希釈を7回行います。最初のチューブは破棄し、最終的な希釈範囲が20 µMから0.625 nMのリンとなるようにします。

次に、オルトリン酸標準液をプレートの最後の2列に分注します。10列目の最初の3ウェルに、A行からH行にかけて0 nMから20 nMのオルトリン酸を順に加えてください。10列目の次の3ウェルに、40 µLのPPおよびGP酵素溶液を加えます。さらに、40 µLのPP、GP、およびNPの3種酵素溶液を加えます。

最後に、すべての6つのウェルに100 millimolar 酢酸緩衝液を 40 µL 加えます。これで、列10の最初の6つのウェルにはそれぞれ 80 µL の溶液が含まれているはずです。次の2つのウェルに、10 M glucose と六リン酸を含む 40 µL の酢酸ナトリウム溶液と、40 µL の PP および GP 酵素溶液を加えます。

テストする各サンプルについて、pH調整したサンプル抽出液 40 µLを、最大8行の1〜9ウェルに分配します。マルチチャンネルピペットを使用して、1〜3列目にPP plus GP酵素溶液を、4〜6列目にPP plus GP plus NPを、そして7〜9列目に0.1 M 酢酸ナトリウム緩衝液を分配します。すべてのサンプルに同等のインキュベーション時間を確保するため、この操作は迅速に行ってください。

96ウェルプレートに蓋をし、サンプル、酵素溶液、コントロール、および検量線用試料を、脱イオン水中で37 °Cでちょうど1時間インキュベートします。4種類のストック溶液をそれぞれ50 mLずつ調製します。溶液Aは、マルチチャンネルピペットを用いて迅速に、毎日調製する必要があります。

96ウェルプレートのすべてのウェルに、25 µLのSDS、100 µLの溶液A、20 µLの溶液B、および50 µLの溶液Cを添加します。プレートに蓋をし、室温で30分間インキュベートします。最後に、波長可変マイクロプレートリーダーを用いて850 nmでの吸光度を測定し、スプレッドシートアプリケーションで管理します。

まず、x軸に0から20 nanomoles phosphorus、y軸に2回測定した吸光度の平均値をプロットして無機リンの検量線を書き、線形回帰を行い、最良適合線の式を求めます。次に、1列目から3列目の値の平均を出し、そのデータセットに検量線を適用することで、背景無機リン量を算出します。続いて、加水分解されたリン酸モノエステルの由来リンを決定するため、4列目から6列目の3反復試料値の平均を出し、そこからコントロール酵素溶液と背景無機リン量を差し引きます。

次に、加水分解されたリンからリン含有量を算出するため、DERsは7列目から9列目の3連試料値の平均を出し、そこから4列目から6列目のコントロール酵素溶液、バックグラウンド無機リン、および加水分解されたモノエステルリンの値を差し引きます。標準的な96ウェルプレートには、8つの試料の結果と検量線が表示されます。コントロールは10列目にあります。

1〜3列目と4〜6列目の間の色の強度の増加は、加水分解されたモノエステルリン化合物によるものであり、4〜6列目と7〜9列目の間の増加は、加水分解されたジエステルリン化合物によるものです。ここでは、ハイスループット酵素加水分解法を用いて、バーモント州の土壌サンプルの0.25 M 水酸化ナトリウムおよび0.05 M EDTA抽出液中のリン化合物のクラス分布の分析に成功しました。このビデオを視聴することで、酵素加水分解を用いて土壌または堆肥抽出液中の天然オルトリン酸、モノエステル、およびジエステルリン化合物を測定する方法を十分に理解できるはずです。

この手法は、環境化学や養分管理の分野の研究者が、土壌や堆肥システムにおける有機態Pの挙動を探索するための道を切り拓くのに役立つ可能性があります。