二次エレクトロスプレーイオン化質量分析法（SESI - MS）を用いて細菌揮発性物質の特性評価

二次エレクトロスプレーイオン化質量分析（CS EMS）により、試料の前処理を必要とせずに細菌揮発性成分の分析が可能になります。細菌培養液のヘッドスペースは、二酸化炭素によってCSSI反応室へと置換されます。揮発性成分がSSI反応室を通過する際、エレクトロスプレークラウドを通過してイオン化されます。

イオン化された揮発性物質は、分析のために質量分析計へと導入されます。過剰なキャリアガスおよび不活性な細菌揮発性物質は、追加の保護策として細菌剤を除去するために0.22 micronのフィルターを通過し、化学フードへと排気されます。最終的に、このCSI MSプロトコルにより、細菌の揮発性フィンガープリントを数分以内に得ることが可能です。

本技術は、呼気による感染症分析や、食品上の病原体を迅速に検出できる食品システムへの応用など、多くの用途に活用できることが期待されます。本手法には、GC-MS、Sift-MS、PTR-MSなどの既存手法に対して、いくつかの大きな利点があります。まず、揮発性成分を分析前に前処理する必要がありません。

第二に、揮発性混合物中の特定のイオンを断片化させることが可能であり、これにより化合物の同定が容易になります。そして第三に、迅速であることです。通常、5分未満で完了します。

各サンプルを分析するために、種の増殖要件および質量分析計への揮発性物質の効率的な輸送を考慮し、培養に適した容器を選択してください。本デモンストレーションでは、標準的な100 milliliterのパイレメディアボトルを選択しました。細菌の揮発性物質は、キャリアガス流によって質量分析計へと輸送されます。

少なくとも2つのルアーポートを備えたネジ付きキャップを用いて、培養ボトルにガスラインを装着します。サンプルの培養を開始する前に、ガス入口ラインと出口ラインをルアーポートに挿入し、それ以外のポートはすべて塞ぎます。容器を加圧し、水に浸して漏れがないか確認してください。

ガス漏れは、揮発性イオンシグナルの弱化または消失という形での非定型的な結果を招く主な原因となります。E. coli K12およびPseudomonas aerogenes PAO1の培養液をLB Lennox培地で調製し、各菌種について2つの生物学的反復サンプルを用意します。

LB Lennox 50 millilitersを入れた滅菌済み培養ボトル9本と、ブランクとして使用する未接種ボトル1本を準備します。それぞれのオーバーナイト培養物を2本のサンプルボトルに接種します。テクニカルリプリケートを作成し、培養物とブランクを37 degrees Celsiusで24時間インキュベートします。CEMSは揮発性物質をサンプリングするように特別に設計されているため、装置を使用する前は、香りの強いパーソナルケア製品の使用を控えてください。

装置およびガス輸送ラインの汚染を防ぐため、ラボ内の揮発性化学薬品にはすべて蓋をし、試験中は可能な限り空気の流れを制御してください。生存可能な生物学的製剤を使用する場合は、搬送ガスラインに適切な孔径のフィルターを設置してください。フィルターは揮発性物質のsesi反応チャンバーへの輸送を妨げませんが、エアロゾル輸送の効率にわずかに影響を与える可能性があります。

電源がオフになっており、システム内の電気が放電されていることを確認するため、電源装置のインジケーターランプがオフになっているかチェックしてください。マルチメーターで電圧が0であることを確認し、電気リードを接地します。この時点で、分析用のエレクトロスプレー溶液をセットしてください。

正イオンモードでは、0.1%ギ酸、5%メタノール、および94.9%水からなるエレクトロスプレー溶液を使用します。最適な信号強度と安定性を得るために、二酸化炭素キャリアガスをオンにし、流量を2 L/minに設定します。エレクトロスプレーリザーバーに圧力をかけ、反応室へのエレクトロスプレー溶液の供給を5 nL/sの流量で開始します。次に、電圧電源をオンにし、電圧を2.5 kVに調整します。

印加電圧は信号イオン強度およびエレクトロスプレーのテイラーコーンの安定性に影響します。本システムでは、2 kVから5 kVの電圧が正イオンモードで最良の結果をもたらします。この段階では、イオン化源の金属表面から危険な感電が発生する可能性があるため、十分に注意してください。次に、MSスペクトルをモニタリングするためのチューニングメソッドを設定します。

マルチチャネル解析またはMCAのチェックボックスを解除します。データ収集時間を10～15分に設定し、データ収集を開始します。キャリアガスのバックグラウンドスペクトルを観察し、安定した全イオンクロマトグラムと再現性のあるスキャンを得るために、印加電圧を微調整します。

装置が安定したことを確認するため、さらに5分間スペクトルとA TICの収集を継続します。実験に合わせて適切な収集パラメータを入力してください。今後の実験に使用するため、キャリアガスのバックグラウンドスペクトルを記録します。

ブランクスペクトルを収集します。キャリアガスの流れをバイパスラインに通し、バルブを閉じた状態でブランクサンプルを装置のトランスファーラインに取り付けます。サンプルボトルのバルブを開き、バイパスラインのバルブを閉じます。

再現性のあるスペクトルを得るため、反応チャンバー内の湿度が安定するまで、システムを30秒間平衡化させます。システムが平衡状態にあることを確認するため、TICをモニターしてください。TICは平衡化期間中に変動し、その後安定します。

システムの平衡状態に達したら、スペクトル収集を開始します。スペクトル収集後、まずキャリアガスのバイパスラインを開き、次にサンプルバルブを閉じてから、サンプルボトルを取り出してください。

最後に、サンプルボトルを取り除きます。キャリアガスでシステムを2～4分間フラッシュし、移送ラインから水分や吸着した揮発性物質を除去して、サンプル間のキャリーオーバーを防止します。各細菌サンプルの揮発性フィンガープリントデータを収集し、徹底的なブランク減算を行うために、適宜追加のブランクスペクトルを収集してください。

LB Lennox培地を用いて37 °Cで24時間好気的に培養したE. coliおよびP. aerogenの正イオンモード揮発性フィンガープリントは、それぞれ明確に異なります。E. coliの揮発性スペクトルは、質量電荷比118のinduが支配的であるのに対し、Pseudomonas aerogenのスペクトルには、より多様なタンパク質付加ピークが含まれています。

本手順を実施する際は、印加電圧、エレクトロスプレー溶液の組成、キャリアガスの流量など、分析に合わせて最適化した装置パラメータを記録しておくことが重要です。また、将来的に分析を再現できるよう、代表的なスペクトルの記録を保持しておくことも重要です。病原性細菌および高電圧を取り扱う作業は、極めて危険であることに留意してください。

したがって、実験中はcss CMSへのアクセスを制限するなど、常に注意を払う必要があります。これで、お使いのシステムにおいて細菌揮発性物質のCSSおよびEMSスペクトルを再現性良く取得できるはずです。ご成功をお祈りします。