細胞間相互作用を操作するためのシリコンマイクロチップ

こんにちは、エリオット・フーです。私はマサチューセッツ工科大学にあるティアの研究室の博士研究員です。本日は、シリコンマイクロメカニカルチップを用いた細胞培養の準備を行います。これらのデバイスは、互いに噛み合う小さな櫛のような形状をしており、2つの異なる細胞集団間の相互作用を精密に制御することが可能です。

本日は、肝細胞とそれを支持するストローマ細胞との相互作用について研究します。具体的には、3T3線維芽細胞をコームの上面で培養しており、コームのフィンガーをずらすことで、細胞を移動させ、その空間的配置を変更することができます。各デバイスは2つのパーツに分かれており、2通りの構成で組み合わせて固定することが可能です。

前者は、2つの細胞集団を互いに接触させます。後者は、2つの集団をわずかに分離させ、細胞が接触できないようにします。ここでは、接触による相互作用は防止されますが、分泌因子を介した相互作用は保持されます。

まず、ピンセットによるパーツの取り扱い方法について説明します。私は、大きめのテフロン製ピンセットと、先端が丸い小さめの金属製ピンセットの両方を使用しています。大きめのピンセットでは、このようにパーツの端を掴むことができます。アームなどの大きなパーツを扱う際は、アームが非常に壊れやすいため、破損させないよう注意してください。

このように、パーツの後端から持ち上げます。金属製ピンセットを使用すれば、穴の中に差し込んでチップを直接拾い上げることができます。大きなパーツは12ウェルプレートの壁に適合し、小さなパーツは24ウェルプレートに適合するか、あるいは大きなパーツと組み合わせて使用します。

12ウェルプレートを使用する場合、通常は金属製ピンセットを使用します。プレート内の部品を操作して2つの部品をはめ合わせる際は、通常、まず大きい方の部品をウェルに入れ、片側に完全に押し付けます。次に、対応する補修部品をウェルの反対側に入れ、2本のピンセットをそれぞれの穴に差し込んで、それらを互いに押し付けます。

これで、ギャップ構成または接触構成のいずれかでパーツを固定することができます。パーツを取り外したい場合は、パーツをギャップ構成まで引き、垂直に引き上げて取り外します。これらのデバイスはシリコン製であるため、適切な細胞接着を可能にするためにコーティングを行う必要があります。

デバイスはあらかじめポリスチレンでコーティングされ、プラズマ処理された状態で届くと思われますので、そこを出発点として進めます。まず、肝細胞が付着する表面をコーティングするためにコラーゲンを使用します。肝細胞用コームを50 µg/mLのコラーゲン溶液に入れ、37 °Cで45分間インキュベートします。

一方、線維芽細胞用コームはコーティングする必要はありません。インキュベーション後、コラーゲン溶液を吸引し、水で洗浄します。次に、ESを相補的なパーツと接触させて固定し、細胞播種のための平坦な表面を形成します。

まず、いくつかのウェルに70%ethanolを満たします。各ウェルに1ペアずつ入れ、それらを互いに固定します。固定後、顕微鏡下で各パーツを確認し、それらが同一平面上にあることを確かめます。

時折、部品がずれた状態で固定されることがあります。その場合、顕微鏡で見ると、部品が2つの異なる焦点面に位置していることがわかります。このときは、単に部品を一度離し、再度合わせて押し込んでください。アライメントが適切であることを確認した後、滅菌のため、部品をしばらくエタノールに浸しておきます。

急いでいる場合は、10分間の浸漬のみで済ませることもあります。滅菌後には、洗浄して取り除く必要があります。エタノールを完全に吸引し、水で洗浄します。その後、再度吸引して水で洗浄し、最後に水を吸引して培養液に交換します。

次に、デバイスへの細胞播種を行います。通常、細胞を500,000 cells/mLの濃度で懸濁し、12ウェルプレートを用いて、各コームペアに1 mLの懸濁液をピペッティングします。ここでは、2つのウェルに線維芽細胞を500,000 cells/mLの濃度で播種しました。

同様に、1ウェルあたり500,000個の肝細胞懸濁液を用意し、他の2つのウェルに播種しました。次に、インキュベートする前に、細胞が均等に分散するように十分に振とうします。私は垂直方向に3回、水平方向に3回振り、この操作を3回繰り返す方法を推奨しています。

振盪させた後、インキュベーターに入れ、細胞を15分間静置します。その後、再び振盪させます。1時間の間、15分ごとに振盪を繰り返し、その後、細胞懸濁液を吸引除去し、新しい細胞懸濁液を添加します。細胞がコンフルエントな層を形成するまで、この操作を繰り返します。

通常、線維芽細胞では1回または2回の播種を要します。また、肝細胞では2回から4回の播種を要する場合があります。コンフルエントな単層を得るために、細胞をかなり高い密度で播種し、揺らすことで細胞が均一に分散するようにします。

1回目の播種後、まばらな細胞層が形成されます。細胞は、ポリスチレンとコラーゲンでコーティングされたフィンガーにのみ接着することに注目してください。新鮮な細胞を播種し、15分おきの振盪を伴いながらさらに1時間インキュベートすると、細胞層の密度が高まります。

3回目の播種後、十分な細胞密度が得られたため、コームへの播種が完了した時点で停止します。次に、細胞を目的の実験構成へと操作します。デバイスを補完パーツから分離し、24時間インキュベートします。

24時間後、細胞は広がってコームの表面を覆うコンフルエントな単層を形成します。次に、共培養を行います。肝細胞コームと線維芽細胞コームを同じウェルに移動させ、目的の初期構成で互いに固定します。

必要に応じて、一定時間経過後に構成を変更してください。例えば、18時間後にギャップ構成へ移行する場合、パーツを同様に配置し、ギャップ構成になるまでしっかりと押し合わせ、その後、再びギャップ構成に戻るように接触させて押し込みます。

次に、コームを1本取り外します。ここからは、古いポリスチレンコーティングの除去、チップの洗浄、そして新しいポリスチレンコーティングの塗布を行い、細胞培養に向けて準備するプロセスを進めていきます。繰り返しになりますが、古いポリスチレンコーティングを除去して新しくコーティングし直すことで、前回の実験の履歴が新しい実験に干渉しないようにします。

実験が終了したら、まず細胞を漂白し、次にコームを水で洗い流してください。チップをチューブに入れる前に、完全に乾燥していることを確認する必要があります。ここでは、しばらくの間自然乾燥させた数枚のコームを用意し、完全に乾いているかを確認しています。

それでは、少量のtoluenをこのガラスビーカーに入れます。溶解を防ぐため、ここではガラスピペットを使用します。toluenはプラスチックを溶解させるため、一般的なポリスチレン製ピペットは使用できません。

これで十分です。次に、これらのパーツを数点取り出してトルエンの中に入れ、シェーカーを回して撹拌させます。トルエンの蒸発を防ぐため、アルミホイルで蓋をします。2時間後には、コーム上のポリスチレンの大部分がトルエンに溶解しているはずですので、コームを取り出して自然乾燥させます。

ハロゲン洗浄後、パーツからポリスチレンが比較的除去され、概ね清潔な状態になります。しかし、新しいポリスチレン層を良好に密着させるには、パーツを極めて清潔な状態にする必要があります。十分に洗浄されていない場合、細胞が牽引力を及ぼし始めた際に、実験の途中でポリスチレンが剥がれる傾向があります。

それでは、ピラニア溶液による洗浄を行います。パーツをガラスビーカーに入れ、加熱します。そのため、ホットプレートの上に置きます。

ここに硫酸と過酸化水素を用意しました。まず硫酸を注ぎ、チップがすべて液中に浸かっていることを確認します。チップは浮き上がる傾向があるため注意してください。

また、腐食性の強い化学薬品を使用するため、適切な保護具を着用していることを確認してください。ここでは、ニトリル手袋を着用しています。次に、過酸化水素を酸に注ぎますが、発熱反応が起こるため、十分に注意してください。

ご覧の通り、反応に伴いわずかに煙が出ていますが、反応性をさらに高めるためにシステムにエネルギーを加えます。そこで、温度を120 °Cまで加熱します。120 °Cに達すれば、チップ上の細胞培養物の残渣が完全に除去されることが保証されます。この時点で、過酸化水素がすべて消費されるまで、反応を最後まで完結させてください。

この時点で、混合液の気泡が出なくなります。したがって、反応が完了するまで約30分かかります。気泡が見られなくなったら、ホットプレートの電源を切り、冷却させます。

次に、それらをBAK緩衝液に移します。ここでも、金属製ではなく必ずテフロンピンセットを使用し、慎重に拾い上げて移してください。その後、定常的なDDH₂Oの流れで洗浄します。通常はメインの供給源から直接出し、少なくとも10分間流し続けます。

このようにして、刻砕後、流水下で10分間洗浄し、酸の痕跡をすべて洗い流します。チップから酸を除去し、Sigma社から入手した分子量45,000のポリスチレンでコーティングする準備が整うまで、水中に保存しておきます。ここで、そのポリスチレンを少量秤量します。

400 mgの試料を用意し、これを100 mg/mLの濃度でトルエンに溶解させます。したがって、トルエンの取り扱いはドラフト内で行う必要があります。また、ポリスチレンを溶解させるためにトルエンを使用するため、ポリスチレン製の実験器具を一切使用しないように注意してください。

ここでは、ポリプロピレン製のコニカルチューブとガラスピペットを使用します。ポリスチレンが 400 mg あるため、トルエンを 4 mL 加えます。次に、ポリスチレンが溶解するまで30分間ボルテックスにか hydrogens。チューブを最低速度で約20分から30分間ボルテックスします。

チューブをボルテックスミキサーに固定します。ずっと手で保持しておく必要はありません。20～30分後にはポリスチレンが溶解し、コーティング準備が整います。

それでは、当施設でポリスチレンのスピンコートを行います。スピンコーターはクリーンルーム内に設置されています。そのため、ここではキャップ、ゴーグル、ガウン、シューズカバー、手袋を着用する必要がありますが、ご利用の施設では規定が異なる場合があります。

このチャックを使用する前に、ポリスチレンから保護する必要があります。そのため、アルミホイルで覆いますが、チップが表面にぴったりと密着するように、できるだけ表面に平らに貼り付けます。チップに真空をかけ続けられるよう、中心に小さな穴を開けます。

スピンコーターを2,400 RPM、30秒に設定します。次に、チップを1枚取り出し、チップの中心が穴を覆うように配置します。ポリスチレンを載せる際は、最初は真空ポンプをオフにし、配置後に真空ポンプをオンにしてからスピンを開始します。小さなパーツの場合、10滴弱を滴下してください。

より大きな部品には、ポリスチレンを10滴強使用します。これを2,400 RPMで30秒間遠心分離します。次に、ポリスチレンでコーティングしたチップを取り出し、120 °Cのオーブンに入れます。これはポリスチレンのガラス転移点以上の温度です。

これにより表面が再溶融してわずかに滑らかになり、プラスチックの緻密化と硬化が進みます。そのため、通常は一晩オーブンに入れておきます。このプロセスが完了するには、少なくとも数時間はかかると思われます。

一晩焼成した後、チップはプラズマ処理が可能な状態になります。ここでポリスチレンに酸素プラズマを照射し、表面エネルギーを変化させることで、タンパク質や細胞の接着性を高めます。チップをプラズマチャンバーにロードし、真空まで排気します。

推奨される設定は、真空度 200 mil、出力 200 watts で、酸素ガスのフロー下で 1 分間処理することです。システムの排気が完了しましたので、酸素を導入します。それでは、RF 電力をオンにし、プラズマを 1 分間発生させます。

プラズマが作動すると、実際に発光します。これは蛍光灯のようなものです。1分間のプラズマ処理後、圧力を大気圧まで戻し、部品を取り出すことができます。

これで、タンパク質コーティングと細胞播種のための準備が整いました。このデバイスの設計目的は、組織の微細構造を動的に操作できるようにすることでした。生体内における組織の微細な構成、特に細胞同士の相対的な配置は、ラボ培養における個々の細胞の機能を決定付ける上で非常に重要です。

最近まで、それを十分に再現することは困難でしたが、ここ5年から10年の間に、組織培養基質上に細胞をマイクロパターニングすることが可能になり、組織培養プレート内の任意の場所に正確に細胞を配置できるようになりました。これにより、マイクロスケールにおける細胞間相互作用の基礎生物学に関する重要な側面をいくつか明らかにすることができました。しかし、現時点でまだ実現できていないのが、それを動的に行うことです。

これは、実験の途中で細胞培養の構成を変更することです。生体内の組織は実際には静的な環境ではなく、特に創傷治癒や発生の過程において、細胞が移動し再編成されるため、この操作は重要になります。

しかし、恒常性が維持されている正常な臓器であっても、多くの物質が絶えず移動しています。技術的に習得するのが最も難しいのは、物理的に各パーツを操作する方法です。最初にこのシステムを扱い始めたときは、パーツがいかに壊れやすいか、あるいは操作に必要な動きがいかに微細であるかに戸惑うかもしれません。

しかし、少しの間練習すれば、それほど苦労することはないと思います。例えば、このデバイスが役割を果たすと考えられる場面の一つに胚発生がありますが、細胞がさまざまな胚層を通り抜けて出芽する際、一連の異なる細胞環境に接触することになります。そして、これらの層に順次接触することによる相互作用が、細胞を特定の分化経路へとさらに押し進めることが分かっています。

したがって、このようなデバイスは、研究室でそのような事象を再現しようとする際に有用であると考えられます。マイクロ組織化において特に検討したかった点の一つは、細胞膜同士が接触し得る接触相互作用による細胞間コミュニケーションと、周囲の培地中に分泌され、少し離れた細胞へと拡散する可溶性因子によるコミュニケーションとの違いです。共培養において細胞同士が互いに影響を及ぼし合う場合、接触相互作用と分泌因子のどちらがその役割を果たしているのかが不明確なことが多くあります。