インフルエンザのためのDNAマイクロアレイ上ampliPHOX比色検出

本実験の全体的な目的は、新規かつ迅速な信号増幅法を用いて、低密度マイクロアレイプラットフォームであるフルチップ上のインフルエンザウイルス亜型を検出し、特性評価することである。これは、ビオチン化DTPを組み込み、5'末端にリン酸基を持つプライマーを使用して、インフルエンザRNA抽出物からマトリックス遺伝子セグメントおよび非構造遺伝子セグメントを増幅させることで達成される。PCRの後、酵素消化および断片化を行い、短鎖の一本鎖ビオチン化増幅ウイルス産物を生成し、これをアレイにハイブリダイズさせる。

Fox検出法では、光重合を用いてハイブリダイゼーションが起こる大きなポリマースポットを形成させ、そのハイブリダイゼーションパターンの違いによってインフルエンザウイルスの亜型を検出します。標準的な蛍光検出などの既存の手法と比較したこの技術の主な利点は、費用が比較的安価であり、蛍光検出と同等の分析感度を持ちながら、肉眼で確認可能な迅速な結果が得られることです。また、本法は汎用的な検出方法であるため、フルチップを用いてインフルエンザウイルスの特性評価に関する知見を得ることが可能です。

Ampl Foxは、他のDNAおよびタンパク質ベースの低密度マイクロアレイなど、多種多様な他のシステムにも適用可能です。理論的には、ビオチン化された産物であれば、amoxを用いて検出できるはずです。本手順のデモンストレーションを行うのは、EndeavorのアソシエイトサイエンティストであるAmber TaylorとリサーチアシスタントのKevin Moultonであり、両名は過去数年間にわたりFox装置および検出化学の開発において中心的な役割を果たしてきました。

ウイルスRNA抽出キットと製造元のプロトコルを用いて、200 µLのウイルス分離液からウイルスRNAを抽出します。最終容量を60 µLとして溶出し、抽出液は後の使用に備えて-70 °C以下で保存します。次に、製造元のプロトコルに従い、氷上でRT-PCRマスターミックスを調製します。

BIOTINYLATED DNTP混合液を用いて、示された濃度のfluチッププライマーミックスをマスターミックスに添加します。酵素消化を促進するため、各セットのプライマーのうち1本には5'末端リン酸基が含まれている必要があります。flu Aプライマーセットは1032 bpの産物を生成し、flu Bプライマーセットは811 bpの産物を生成します。

マスターミックスを軽くボルテックスし、18 µLずつ薄壁PCRチューブに分注します。次に、各反応チューブに2 µLのRNAテンプレートを加えます。PCRチューブをサーマルサイクラーに移し、適切なアニーリング温度に設定したサイクル条件で反応させます。

本アッセイで使用したサイクリングプロファイルをここに示します。PCR反応1回あたり、酵素反応バッファー 2.2 µL、ヌクレアーゼフリー水 0.8 µL、およびlambda exonuclease 1.0 µLを混合して、酵素消化ミックスを調製します。サーマルサイクラーからサンプルを取り出し、各PCRチューブに4 µLずつ加えます。

サンプルをサーマルサイクラーに戻し、図に示すように37 °Cで15分間、続いて95 °Cで10分間となるようプログラムします。次に、ハイブリダイゼーションを行うマイクロアレイの周囲に使い捨てのハイブリダイゼーションウェルを装着します。その後、オービタルシェーカーを用いて、110 mLの精製水でスライドを5分間洗浄します。

ウェルの縁にティッシュワイプをそっと触れさせ、スライドを乾燥させます。2xハイブリダイゼーションバッファー22 µLを、それぞれ短時間混合した断片化シングルストランドDNA産物に加え、マイクロアレイウェルに40 µLずつピペッティングします。加湿チャンバー内で1時間ハイブリダイゼーションを行います。ハイブリダイゼーション後、スライドを加湿チャンバーから取り出し、各スライドを2 mLの洗浄バッファーDで短時間すすぎます。スライドをスライドラックに配置します。

次に、オービタルシェーカーを用いて、洗浄バッファーAおよびBをそれぞれ110 millilitersずつ別々の容器に入れます。スライドラックをバッファーAに入れ、60 to 90 RPM（以降のすべての洗浄で使用する速度）で1分間洗浄します。その後、スライドラックを洗浄バッファーAから取り出し、洗浄バッファーDで軽くすすぎます。スライドラックを洗浄バッファーBに移し、オービタルシェーカーで5分間洗浄します。

洗浄後、各スライド上のアレイをティッシュワイプで静かに乾燥させ、乾燥したスライドを加湿チャンバーに入れます。FOX比色検出ステップの準備として、処理するアレイ1つにつき、10 µLのamplitude、20 µLの2x amplitude buffer、および10 µLの精製水を混合します。ラベル混合液 40 µLを各アレイに分注し、密閉した加湿チャンバー内で5分間ラベル化反応を行います。ハイブリダイゼーションの間に、容器に110 mLのwash buffer Cを準備します。ラベル化後、直ちに各アレイをwash buffer Dでリンスします。各スライドをスライドラックに入れ、オービタルシェーカー上でwash buffer Cを用いて5分間洗浄します。buffer Cによる洗浄後、スライドラックを精製水の入った容器に3回短時間浸します。

塩分残留物を除去するため、前述の方法でアレイを乾燥させます。光活性化およびイメージングを行うまで、アレイを遮光スライドボックスに保存してください。なお、これらの操作は24時間以内に完了させる必要があります。次に、Amli Foxリーダーの電源を入れ、アレイサンプルの検出前にAmli viewソフトウェアが光活性化の準備ができていることを確認してください。

まず、短いキャリブレーション手順に従って、すべてのサンプルの最適な光活性化時間を決定します。1日の使用につき一度、Amplify溶液を室温まで温めてから短時間ボルテックスして混合し、3 µLのAmplifyエンハンサーをAmplifyバイアルにピペッティングして十分にボルテックスします。10秒間かけて、気泡が入らないように注意しながら、一度に1枚のスライドにのみ40 µLのAmplify溶液を均一に塗布します。

マイクロアレイスライドをAmplify Readerの光活性化ベイに挿入します。キャリブレーション工程で決定した光活性化時間を設定し、PL viewソフトウェアで「start」を選択して光活性化を開始します。完了後、精製水2 mLでマイクロアレイを洗浄し、過剰なamplify clearポリマーを除去します。これにより、標的DNAを含むスポットでのポリマー形成が完了し、より明確に視認できるようになります。

染色後、ポリマースポットを2分間乾燥させます。次に、Amply Redをアレイ上に2滴滴下し、2分間染色を行います。染色後、スライドを精製水で速やかにすすぎ、前述の方法で乾燥させます。スライドをAmli Foxリーダーのイメージングベイに挿入し、Amliソフトウェアを用いて画像を収集し、結果を処理します。左の画像は、Amli Foxによる2009年の新型H1N1検体の検出結果を示しています。

右側の画像は共焦点蛍光マイクロアレイスキャナーによって生成された従来の蛍光を用いていますが、どちらの手法でも全体的に同様の検出パターンが容易に確認できます。しかし、Amli foxの結果は肉眼で視認可能です。これらの画像は、ヒト由来のH3N2、ヒト由来のH1N1、豚由来のH1N1、およびインフルエンザが検出されなかったネガティブコントロールのfoxアレイによるfluチップの結果を示しています。

青色で囲まれた配列2および3は、示されているすべてのインフルエンザ亜型に対してシグナルを生成します。一方、右下の赤色で囲まれた配列は、豚由来のH1N1検体に対してのみシグナルを生成します。陰性検体では、緑色で囲まれた内部コントロール配列にシグナルが見られ、RT-PCR反応の阻害や失敗がなかったことが示されています。

一連の工程を習得すれば、バイアルからの抽出からamox検出、および最終的な結果の判定までを約6時間で完了させることができます。機器のキャリブレーションを含むAmpl Fox検出の手順は、本プロトコルに従えば約30分で完了します。さらに詳細な検討が必要な場合は、部分的なゲノム解析や全ゲノム解析などの他の手法を実施することが可能です。

このインフルエンザアッセイは、特に固有のハイブリダイゼーションパターンを示すサンプルに対する初期スクリーニングを目的としています。検出は汎用的なアッセイであるため、検出によって価値を高めることができる、低密度マイクロアレイの新しく興味深いアプリケーションを研究者が発見することを期待しています。