絶縁型、ベンチレーテッド、および計装のマウス肺の特性評価は、拍動流を灌流

拍動性の肺血圧・血流関係を研究すること。本プロトコルでは、マウスの肺を摘出し、換気および灌流させる方法について説明します。換気のために気管を外科的に露出させます。

次に、肺動脈と左心房にカニューレを挿入できるよう、心臓と肺を摘出します。その後、肺系に灌流を行います。肺動脈血流の流量、振幅、波形、または周波数を変化させることで実験を行います。

得られた肺動脈および左心房の圧力波形を記録し、脈動性の肺血流圧関係を実証します。in vivo調製などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、体積状態、交感神経系の緊張、活動、および麻酔の影響による変化を排除した状態で、脈動性の圧力・血流関係を得ることができる点にあります。

また、ほとんどの孤立肺標本では定常的な圧力-流量関係のみが測定されますが、本手法では拍動性の圧力-流量関係を決定することが可能です。この手法は、肺血管疾患が拍動性の肺血行動態にどのように影響するか、あるいは主肺動脈の硬化が右室後負荷にどのように影響するかといった、肺生理学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。心臓と肺を露出させ、肺動脈にカニューレを固定する操作は習得が困難であるため、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。

器具による過剰な圧は肺浮腫を引き起こす可能性があり、カニューレの不適切な留置は肺動脈を穿刺させる恐れがあります。実験を開始する前に、孤立肺の換気および灌流に使用するIL oneシステムの準備が必要です。チューブを圧力トランスデューサに接続してください。

単一のポンプと流量計を用い、37°Cに加温した蒸留水でシステム全体を完全にフラッシュし、チューブ内の気泡を除去します。次に、Endur techポンプのチューブを1%PBSでプライミングします。その後、ゼロ点調整を行います。

まず、IL 1システムへのバルブを閉じ、大気へのバルブを開いて、各P 75トランスデューサーの圧力を調整します。次に、プラグSISアンプを使用して圧力を自動的にゼロ合わせします。動物の準備として、セラミック多孔質片を蒸留水に浸し、IO 1セットアップを加湿します。マウスを麻酔後、前肢をコルクボードにピンで固定し、手術のためにマウスを安定させます。

次に、胸部に95%アルコールをスプレーします。直鉗子で頸部の皮膚をつかみ、直剪刀で1 cmの切開を行います。頸部の内部が露出したら、食道と気管を探しながら、表在筋にある白い腺組織を切り取り除去します。

食道と気管の周囲および後方の組織を剥離し、気管に緩い縫合糸をかけます。気管にカニューレを挿入するため、小鋏を用いて気管の片側に小さなV字状の切開を慎重に加えます。その後、鈍端鉗子を用いてマウスをIL oneシステムへ移動させます。

気管カニューレを掴み、気管内に挿入します。縫合糸でカニューレを固定します。まず室気で換気を開始し、胸部をアルコールで消毒した後、直鉗子と直剪刀を用いて皮膚を除去します。

胸骨に沿って皮膚を上方に向かって切開します。両側の皮膚を持ち上げ、下位肋骨のラインに沿って切開します。次に、ピンセットで剣状突起をつかみ、ボールチップシザーを用いて、胸骨の下端と接する横隔膜に穴を開けます。

横隔膜をつかみ、肋骨から切り離します。丸先剪刀を用いて、再び剣状突起をつかみ、肺、心臓、または血管を損傷しないように注意しながら、肋骨を通して胸骨を上方へ慎重に切開します。心臓を露出させるため、左側の肋骨をつかみ、その先端を切除します。

次に、右心室に0.1 millilitersのヘパリンをゆっくりと注入します。注入後、残りの肋骨を切り取り、顕微鏡下で肋骨をカットしながら、鉗子の背面または丸い端を用いて肺を肋骨から慎重に押し除けます。心臓上の脂肪にある腺組織を除去します。

ピンセットを使用して組織をかき分け、切り取り除きます。スプリングシザーを用いて大動脈と肺動脈に縫合糸をかけ、鈍端ピンセットで心臓をそっと持ち上げます。この際、抵抗はほとんどないはずです。

次に、ダブルスローで緩い結節 suture を結びます。続いて、下腹部を切り離します。角度付きの剪刀を用いて、肋骨と脊椎を切り進めてください。

これにより、かなりの量の血液が流れます。綿棒を使用して止血してください。出血が止まったら、10 mLのRPMIを満たしたシリンジを用いて、4 mLのRPMIでILシステムをプライミングします。

チューブ内に気泡がないことを再確認してください。次に、心尖部付近に小さな切り込みを入れてカニューレを挿入し、右心室をカニュレーションします。肺動脈に到達するように下方向に向けて挿入してください。肺動脈のほぼ透明な壁を通して、プローブの先端が見えるはずです。

次に、左心室にカニューレを挿入するため、カニューレ、大動脈、および肺動脈の周囲で縫合糸を締め付けます。心尖部に切り込みを入れ、左心房に向けて上方にカニューレを挿入します。弁を見つけるためにわずかな圧力をかける必要があるかもしれませんが、一度見つかれば、カニューレは滑り込み、縫合糸なしで固定されます。

流出チューブに流れが見えるまで、10 mLシリンジから0.3 mL/分でRPMIを手動で注入します。流出チューブに流れがない場合は、左心室カニューレの位置を調整してください。ただし、肺に流れがない場合は、肺動脈にリークがある可能性が高いため、実験を中止してください。

心臓へのカニューレ挿入が完了したら、60 mLシリンジをIL 1システムに接続します。定流量ポンプを使用し、RPMI Perfuse 8を1 mL/minの速度で注入します。初期灌流時に漏れがないか確認してください。

さらに2分間、徐々に肺に灌流させます。この間に肺は白色に変化します。拍動流の研究を行う場合は、まず単独ポンプのピストン変位量を目的のレベルに設定してください。

次に、定常流速を設定します。osliポンプのバルブを開き、osliフロープロファイルの実行直前にデータの記録を開始してください。完了後、データ出力ファイルを開き、初期試行の実験流速に基づいて実験的なフローをプロットします。

Q maxが希望の値になるように、各周波数における振動ポンプのピストン変位を調整します。定常流試験のデータ収集中は、換気を一定圧力に維持し、単独ポンプへのバルブを閉じて定常流量を希望のレベルに設定してください。データの記録を開始し、定常流プロトコルに従って手順を進めます。

各試行間の流速において、少なくとも10秒間データを収集します。流速を0.5 milliliters per minuteにリセットしてください。データ収集中は、換気圧を一定に保持するようにしてください。

左心房圧ゼロの試行を行う場合は、試行中に流出チューブを取り外してください。気道チューブ内にRPMIが流入していないか注意深く監視してください。RPMIが気道圧トランスデューサーに到達すると破損するため、絶対に到達させないでください。

上段に流量 Q、2段目にそれに対応する肺動脈圧および左心房圧を示した、さまざまな条件下での定常流灌流の結果を以下に示します。最初の2つのパネルでは、流出チューブが装着されていたため、左心房圧は Q に伴って増減しました。1番目のパネルは呼気終末圧、2番目のパネルは吸気終末圧における空気圧を示しています。次に、チューブを取り除いたことで、左心房圧は一定となり Q に依存しなくなりました。その後、流出チューブの高さを手動で調整し、左心房圧を上昇させました。

また、Qとは独立して、最初のパネルは呼気終末陽圧（PEEP）と吸気圧を、2番目のパネルは呼気終末陽圧を示しています。それぞれのケースにおける肺動脈圧と血流の定常的な関係は、圧力対流量をプロットすることで得られます。

上段パネルには脈動流灌流の結果である流量 Q と、それによって生じた肺動脈圧、左心房圧、および空気圧が示されています。下段パネルをご覧ください。これらの脈動肺血圧と流量の関係から、右室後負荷の総和を反映する肺血管インピーダンスを算出することができます。

この手技に習熟すれば、20〜30分で完了させることができます。この手順を行う際は、手を震わせないよう、時間をかけて心身をリラックスさせることが重要です。肺に十分な灌流が行われれば、困難な工程は終了となります。

本手順に続き、肺組織を用いて組織学的検査や生化学的アッセイなどの他の手法を実施することができ、肺の脈動圧と流量の関係で観察された変化にどのような分子メカニズムが関与しているかといった追加の疑問を明らかにすることが可能です。この手法は、肺生理学分野の研究者が、遺伝子改変マウスを用いて肺血管疾患の発症および進行における特定の遺伝子やタンパク質の役割を探索するための道を開くものです。