ライブラット皮質ニューロンのミトコンドリア膜電位と活性酸素種の定量

この手順の目的は、蛍光プローブであるTMRMおよびH 2D CFDAを用いて、初代皮質ニューロンにおけるミトコンドリア膜電位および活性酸素種レベルをそれぞれ測定することです。まず、TMRMとH 2D CFDAのストック溶液および作業濃度溶液を調製します。次に、皮質ニューロンをTMRMおよびH 2D CFDAとともに、Thai roads bufferを用いて室温で45分間インキュベートします。

3番目のステップは、生きた皮質ニューロンにおいて、TMRMおよびDCFの蛍光強度を、それぞれ515/517 nmおよび488/515 nmの励起・蛍光波長を用いてイメージングすることです。ミトコンドリア脱共役剤であるFCCP存在下でのTMRM蛍光の変化をモニタリングし、一方で過酸化水素存在下でのDCF蛍光の変化をモニタリングします。この手順の最終ステップは、データの収集、正規化、および解析です。

最終的に、FCCP処理および過酸化水素処理の前後におけるTMRMおよびDCFの蛍光強度の相対値をそれぞれグラフにプロットすることで、結果を得ます。こんにちは、Joanna Koskaです。ロヨラ大学シカゴ校の私の研究室へようこそ。

本日は、ラット皮質ニューロンにおけるミトコンドリア膜電位および活性酸素種の測定方法について解説します。手順のデモンストレーションはdhiが行います。こんにちは、Denise Jossiです。

この手順を用いることで、単一ミトコンドリアラベルでのミトコンドリア膜電位の測定、および単一細胞ラベルでの活性酸素種の測定が可能です。それでは、開始しましょう。5 mgのTMRMを1 mLの無水ジメチルスルホキシドに溶解し、1分間ボルテックスして、10 mMのTMRMストック溶液を調製します。

次に、分注して-20°Cで保存します。遮光し、1ヶ月以内に使用してください。続いて、4.87 mgのH 2D CFDAを1 mLの無水ジメチルスルホキシドに溶解し、10 mMのH 2D CFDAストック溶液を調製します。

同様に、1分間ボルテックスした後、分注して-20°Cで保存します。遮光し、1週間以内に使用して、まずラット皮質ニューロンにTMRMをロードします。培養ニューロンをTyrode緩衝液で3回洗浄します。

次に、10 millimolarのTMRMストック溶液をtbで1000倍に希釈し、20 nano molarのTMRMを調製します。その後、tb 1 milliliterあたり2 microlitersの希釈TMRMを加えます。ニューロンをTMRMとともに、室温・暗所にて45分間インキュベートします。

45分後、培養皿を顕微鏡のステージに載せ、ラット皮質ニューロンにH 2D CFDAをロードするためのイメージングを開始し、培養ニューロンをtbで3回洗浄します。次に、10 millimolarのH 2D CFDAストック溶液をtbで10倍に希釈し、2 micromolarのH 2D CFDAを調製します。その後、tb 1 milliliterあたり2 microlitersの希釈済みH 2D CFDAを添加します。

その後、ニューロンをH 2D CFDAとともに、室温・暗所にて45分間インキュベートします。過剰な蛍光指示薬を除去するため、ニューロンをTBで4 times洗浄し、ライブタイムシリーズプログラムを用いて、TMRMでインキュベートしたニューロンのライブイメージングを共焦点レーザー走査顕微鏡により行います。画像取得時間を短縮し、光退色を避けるため、低解像度および減衰させたレーザー出力を適用してください。

次に、反射光を用いて、TMRMで負荷した固定ニューロンのフォーカスを調整します。540 nmで励起し、570 nmで検出することで、TMRMの蛍光を観察します。解像度、レーザー出力、カメラのゲイン、画像取得の時間経過インターバルを含むすべてのパラメータを設定した後、カメラの検出ゲインを飽和レベルの直下に設定します。

実験間でこれらの設定を変更しないでください。次に、視野を移動します。ΔΨM刺激による変化をテストするための画像収集を開始します。例えば、1 µMのFCCPまたは2 µg/mLのoligomycinを添加することで、ミトコンドリア膜電位をそれぞれ著しく脱分極または過分極させることができます。

これらの変化は、FCCPの場合にはベースラインの蛍光強度と比較してTMRM蛍光強度の低下として、あるいはTMRM蛍光強度の増加として反映されます。H 2D CFDAでインキュベートしたニューロンのライブイメージングを行う場合は、まず培養皿を顕微鏡のステージに載せ、反射光を用いて細胞の焦点調整を行います。励起波長 4 88 nanometers、蛍光波長 five 15 nanometersでDCF蛍光を観察してください。

次に、レーザー出力を5～7%に調整し、ゲインを検出して解像度を256×256に設定します。これらの設定は、実験間で変更しないでください。その後、ライブイメージを取得するための周波数を設定します。

タイムシリーズプログラムを使用して、新しい視野を選択し、R osレベルの変化を検出するための画像取得を開始します。細胞に100から200 µMの過酸化水素を添加します。これにより、ベースラインレベルと比較してDCFの蛍光強度の増加が認められます。

LSMプログラムの関心領域（ROI）ツールを使用して、領域を選択します。次に、TMRMまたはROSの蛍光強度をそれぞれ測定するため、画像内のミトコンドリア領域のROI、または細胞体全体のROIを選択します。

細胞に隣接する領域を選択します。背景蛍光強度を算出するために、数箇所で測定を行います。各タイムポイントにおける各細胞の関心領域（ROI）の平均蛍光強度から、Microsoft Excelを用いて平均背景蛍光強度を差し引き、平均背景強度を算出します。背景強度を差し引いた後、TMRMまたはDCFの蛍光強度をベースライン蛍光で正規化します。

この計算式を用いて、Sigma Plotプログラムで蛍光強度の時間的変化を示すプロットを作成します。こちらは、TMRMでインキュベートしたラット皮質ニューロンの蛍光画像の例です。F-C-C-P-Aミトコンドリア脱共役剤を添加すると、ミトコンドリアの脱分極が起こり、TMRMの蛍光強度が低下します。

FCCP添加前は、TMRMのベースライン蛍光レベルが安定して推移します。TMRM蛍光の時間的変化を定量分析すると、FCCP添加後にTMRM蛍光が有意に減少することがわかります。ここでは、DCFをロードしたラット皮質ニューロンの蛍光画像の例を示します。

過酸化水素を添加する前の最初の120秒間、DCF蛍光のベースラインレベルは不変のままです。過酸化水素を添加すると、細胞体においてDCF蛍光強度の増加が認められます。DCF蛍光のタイムラプス測定では、過酸化水素処理後に上昇し、その後安定したレベルにあることが示されています。

この手順では、光退色や光毒性によるアーティファクトを避けるため、低レーザー出力と高速スキャン速度を使用することが重要です。実験の成功をお祈りいたします。