使用してMG53を介した細胞膜修復の可視化 in vivoでと in vitroでシステム

この手順の全体的な目的は、動物個体および単離細胞の両方において、膜修復能を評価することです。単離した骨格筋線維を回収し、FM 1 43 染料を含む培地で囲みます。次に、UVレーザーを用いて細胞膜の一部に照射し損傷を与えることで、染料を細胞内に進入させます。

単離した細胞に、細胞膜および細胞質に局在するGFP MG 53を発現するプラスミドDNAをトランスフェクションします。次に、マイクロ電極の先端をC two C 12膜に挿入し、損傷を誘導します。最終的に、損傷部位へのGFP MG 53の移行を示す結果を得ることができます。

マイクロ電極の刺入および筋線維の単離技術を習得するには習熟が必要であるため、本手法の視覚的な実演が不可欠です。手順の実演は、ラボマネージャーのLin博士、ポストドクターのWazu博士、大学院生のMatt Orange氏、および当科のリサーチアシスタントプロフェッサーであるShaza博士が行います。まず、実験中の動物から出る廃棄物を回収するため、トレッドミルの下にトレイまたは青色のラボパッドを設置してください。

次に、トレッドミルの表面の角度を設定します。トレッドミルによっては、傾斜を調整するための装置が組み込まれているものもありますが、他の方法でトレッドミルを高くする必要があるものもあります。一般的には、水平面、または下りか上りの7度から15度の角度が用いられます。

電気グリッドをオフにし、ベルト駆動モーターをオンにした状態でマウスをトレッドミルに乗せ、慣らし運転を行います。ただし、慣らし期間の15分間はベルトを動かしません。慣らし期間の後、モチベーション維持のための電気グリッドをオンにします。トレッドミルを、初期速度約5 m/minで開始します。速度を1分ごとに1〜2 m/minずつ上げ、動物に5分間のウォーミングアップ期間を設けます。

テスト中のコンプライアンスを高めるため、このウォーミングアップ期間を3日から10日間、毎日繰り返します。急性疲労運動を行うには、最大速度に達するまでトレッドミルの速度を徐々に上げ、疲労の兆候をモニタリングしてください。

トレッドミルから外れている時間が合計時間の半分を超えたか、またはグリッド上に5秒間連続して留まった場合に、その動物は疲労状態にあるとみなされます。疲労したマウスを取り除き、総走行時間を記録します。持久力トレーニング。

ランニングプロトコルはすべて同様のウォームアップ手順から開始します。ただし、最大速度は一般的により低く、走行時間はかなり長くなる場合があります。テスト終了後、マウスをホームケージに戻し、トレッドミルを70% ethanolで清掃してください。

さらなる解析のため、足底の短趾屈筋の浅層を分離します。まず、下層の筋肉を傷つけないように注意しながら、足底の皮膚を正中線で切開します。次に、水平方向に切開を加え、皮膚を除去します。

踵骨に付着しているFDB筋の平坦で白い腱を特定します。ピンセットを用いて腱を分離し、付着部位に近いところで切断します。結合組織を取り除きながら、腱をゆっくりと引き上げます。

遠位腱が個々の指に分かれる部位を確認します。腱が深層の筋肉と接続している箇所で切断し、FDBを摘出します。FDB筋肉束を、37 °Cに予熱した1 mLのコラゲナーゼ溶液に入れます。

チューブを37 °Cのオービタルシェーカーに水平に固定し、200 RPMで65分間振盪します。十分な消化が進むと、外観が崩れ、色が淡くなります。消化された束が通過できるよう、1 mLピペットチップの先端を切断します。

束を、約600 µLの2.5. Calcium tyroを含む遠心チューブに容易に移します。チューブを静かに反転させ、束から緩んだ繊維を振り落とします。

次に、30 µL ピペットチップの先端を切り、直径が筋束よりもわずかに小さくなるようにします。このチップを使用して筋束をピペット内に吸い込み、その後、溶液中に押し戻します。繊維の大部分が筋束から解離するまで、この操作を繰り返します。

チューブをゆっくりと回転させて、解離した繊維を混ぜ合わせます。必要な量を分注し、ガラスボトムのdelta Tディッシュに滴下します。残りの繊維は、後の使用や追加研究のため、4 °Cで約6時間保存します。

ディッシュを5分間静置します。これにより、繊維がディッシュのガラス底面に付着します。ガラス底ディッシュを、UVレーザーを搭載した共焦点顕微鏡に設置します。

位相差顕微鏡を用いて100倍以上の倍率で繊維を観察し、正常な横紋パターンと直線的な棒状の形状を確認します。溶液にFM 1 43またはFM 4 64 styro perineum染料を加え、最終濃度を2.5 micromolarにします。損傷を誘発するため、視野の左上から右下に向かって繊維を45度の角度に配置します。

プラズマ膜の5×5ピクセルの領域を照射します。最大出力に設定したUVレーザーを用いて5秒間照射し、照射領域がプラズマ膜を分断するようにします。このとき、5×5のボックスの半分がファイバーの内部に、残りの半分がファイバーの外部になるようにしてください。その後、最大5分間、5秒間隔でファイバーへの色素の進入画像をキャプチャします。蛍光色素は最終的にファイバー内にエンドサイトーシスされるため、データ解析を困難にさせないよう、1枚のディッシュにつき照射するファイバーは3本までに制限してください。

ファイバーを3本使用した後は、新しいディッシュを調製してください。解析ソフトを用いて、ファイバー間での比較のために、約200平方ミクロンの領域における蛍光強度の変化を算出します。各フレームについて、delta F / F zero の計算を行ってください。ここで、F zeroは最初にキャプチャしたフレームにおける関心領域の平均蛍光強度であり、delta Fはそれ以降の各フレームにおける蛍光強度の変化量です。

標準的な手法を用いて、GFP MG 53を発現するプラスミドDNAを細胞にトランスフェクションします。次に、マイクロピペットを準備します。マイクロピペットにPyrexキャピラリーを装着します。

プリセットプログラムに従ってプルおよびプルを行います。マイクロピペットを3軸マイクロマニピュレーターに装着します。delta T ディッシュから培地を除去し、2.5 millimolar カルシウム含有タイロ緩衝液に置換します。

40倍 1.3 NA 油浸対物レンズを備えた共焦点レーザー走査顕微鏡に、トランスフェクション済み細胞を含むディッシュを設置します。マイクロピペットを細胞膜に刺入し、その後速やかに引き抜くことで、生細胞に急性損傷を与えます。トロポニンによる膜破壊について、1フレームあたり1.54秒の間隔で連続的に生細胞画像を収集します。

イメージングを行う細胞の直上に、0.005% troponinを約1 mL/minの速度で灌流します。トレッドミルを用いて、走行能力の低下を測定できます。ここで示しているMG 53ノックアウトマウスは、骨格筋の損傷により走行能力が低下しています。

UVレーザーによって引き起こされる損傷の程度は、観察される繊維の膜修復能によって異なります。ここでは、正常マウスにおける損傷前の繊維を示します。この画像は200秒後に撮影されたもので、軽微な損傷が認められます。

膜修復能が低下したMG 53ノックアウトマウス由来の筋線維では、損傷後に、より顕著な色素の流入が見られます。ここでは、損傷を受けていないGFP MG 53導入C2C12筋管の例を示します。この画像の矢印は、損傷部位に向かって移動するGFP MG 53含有小胞を指しています。

この例では、サポニンを用いて細胞膜を損傷させました。損傷後、GFP MG 53が細胞質から細胞膜へと転位することに注目してください。この手順を行う際は、平滑な筋細胞膜と明瞭な横紋パターンを持つ、質の良い筋線維を単離することが重要です。

このビデオを視聴することで、筋肉の膜修復能力の評価方法、および細胞の培養方法について十分に理解することができます。