3D楕円体の生成のための簡単​​なハンギングドロップ細胞培養プロトコル

本実験の目的は、3D組織のようなステロイド様構造を生成することです。まず、培養細胞を回収し、単一細胞懸濁液を調製します。次に、細胞懸濁液を組織培養皿の反転させた蓋の裏面に滴下して配置します。

次に、蓋を反転させて加湿チャンバーに被せます。最後のステップとして、凝集塊を形成させるために、吊り滴法で24～48時間インキュベートします。その後、これらを振盪水槽に移し、さらに最大5日間インキュベートすることができます。

最終的に、凝集アッセイ、組織表面の対称性の評価、またはエピ蛍光顕微鏡観察を通じて、凝集体の凝集力や細胞分別の違いを示す結果を得ることができます。例えば、従来の2D組織培養などの既存の手法と比較したこの手法の主な利点は、3Dで育成された細胞が、組織環境内の細胞が経験する細胞間相互作用をより忠実に模倣していることです。本手法が、PI（研究責任者）でさえ実行できるほど簡単であることを、実演して説明します。

本実験を開始するために、コンフルエンシー90%で接着細胞を回収します。まず、培地を吸引し、細胞シートをPBSで2回洗浄します。次に、PBSを吸引し、0.05% Trypsin-EDTA溶液 2 mLを単層細胞の上にピペットで添加します。

プレートを37 °Cの組織培養インキュベーターに入れ、細胞が剥離するまでインキュベートします。次に、プレートをインキュベーターから取り出し、完全培地2 mLを加えて処理を停止させます。

5 mLピペットを用いて、細胞が完全に懸濁するまで混合液をピペッティングします。次に、細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに移します。10 mg/mLのDNA溶液を40 µL、細胞懸濁液にピペットで加え、室温で5分間インキュベートします。

細胞懸濁液を短時間ボルテックスした後、200 ×gで5分間遠心分離します。遠心分離が完了したら、上清を吸引して廃棄し、ペレットを1 mLの完全培地で再懸濁して洗浄します。再度遠心分離を行い、ペレットを1 mLの完全培地で再懸濁します。

次に、自動細胞カウンターまたは血球計数器を用いて細胞数を測定します。培地を用いて細胞懸濁液を調整し、最終濃度を2.5 × 10⁶ cells/mLにします。その後、吊り滴法の作製に進みます。

60 mm 組織培養皿の蓋を取り外し、皿の底に 5 mL の PBS をピペッティングして加湿チャンバーを準備します。プレートの蓋を裏返し、細胞懸濁液を 20〜10 µL のドロップとして蓋の裏側にピペッティングします。ドロップ同士が接触しないよう、十分に間隔を空けて配置してください。

ドロップ培養液を含む蓋を、PBSが入ったディッシュの底にそっと戻します。培養プレートを組織培養インキュベーターに入れます。37 °C、5% carbon dioxide、95% humidityに設定し、一晩インキュベートします。

ドロップを毎日観察し、細胞シートまたは凝集塊が形成されるまでインキュベーションを継続します。細胞シートまたは凝集塊が形成されたら、それらを3 mLの完全培地を含む丸底ガラスシェーカーフラスコに移します。細胞シートまたは凝集塊が入ったフラスコを、振盪水槽でインキュベートします。

ステロイドの形成が解剖顕微鏡下で観察できるようになるまで、37 °C、5% 二酸化炭素条件下で約24時間維持します。ステロイドが形成された後、実験的操作がステロイド形成に及ぼす影響を、書面によるプロトコルに記載された手順に従って定量化できます。また、あらかじめ添加した蛍光染料の膜へのインターカレーションを、蛍光顕微鏡を用いて観察することが可能です。

この明視野顕微鏡画像は、吊り滴法を用いて18時間培養した後のラット前立腺がんMLL細胞の凝集を示しています。この画像は、吊り滴法による18時間の培養後に形成されたMLL細胞の2つ目の凝集塊を示しています。これらの細胞は25 micromolarのMEK阻害剤PD 9 8 0 5 9存在下で培養されており、その結果、細胞凝集塊は大幅に緻密になっています。

ここでは、MEK阻害剤で処理したMLL吊り滴培養の凝集塊サイズと、未処理のコントロールの凝集塊サイズの差を示します。アスタリスクは、P値が0.0001未満の統計的に有意な差を表しています。これは、未処理の凝集塊とMEK阻害剤処理した凝集塊の間でt検定を行った結果であり、MEK阻害剤処理によって凝集塊が有意に小さく、よりコンパクトになることを示唆しています。

この画像はNikon Smz 800実体顕微鏡を用いて撮影されたもので、鶏胚肝細胞をハンギングドロップ法で18時間培養し、その後37 °Cの振盪水槽で48時間培養して形成されたステロイド様構造を示しています。この共焦点顕微鏡画像は、ハンギングドロップ法を用いて特定の細胞集団を共培養した際に起こるソーティングアウト挙動を示しています。ハンギングドロップ培養に移行する前に、鶏胚肝細胞は膜間染色剤であるpkh twoで染色されました。

心細胞をPKH 26で染色した。その後、細胞懸濁液を混合し、ハンギングドロップ法に供した。18時間培養し、続いて37 °Cの振盪水槽内で48時間インキュベートした。

光学切片から、黄色に染色された心細胞が肝細胞に包まれていることがわかります。ここでは青色に擬似着色されており、表面にNCAを発現させた2つのnardiおよびトランスフェクトされたL細胞クローンです。2.4対1の比率で、等量混合した蛍光膜挿入色素PKH 2およびPKH 26で染色し、前述と同様に吊り滴法で培養しました。

この例では、緑色に擬似着色された高発現のcadian発現細胞が、赤色に擬似着色された低発現のen cadian発現細胞に囲まれています。この手法を習得し、適切に実施すれば、30分以内で完了させることができます。