細胞の成熟せずに樹状細胞の効率的なトランスフェクションに最適化されたプロトコル

この手順の全体的な目的は、siRNAトランスフェクションによってDCS中の標的遺伝子の発現をノックダウンすることです。これは、まずAM Maxin Nucleoエフェクターをプログラミングすることによって達成されます。手順の次のステップは、DCSとsiRNAを混合し、得られた細胞溶液をNucleo QVEモジュールにピペットで分注することです。

手順の3番目のステップは、プレートをamaxaシャトルトレイにセットしてトランスフェクションプロセスを開始することです。手順の最終ステップは、細胞にウイルスを感染させ、インターフェロン応答を活性化させることです。最終的に、定量R-T-P-C-Rおよびウェスタンブロッティングを通じて、遺伝子ノックダウンを示す結果を得ることができます。

この手法は、樹状細胞におけるシグナリング経路の特性解析に有用であり、樹状細胞を用いた免疫療法の開発に寄与する可能性があります。DCトランスフェクション用にMaxon 96ウェルシャトルヌクレオファクターをプログラムするには、新しいパラメータファイルを開きます。96ウェルプレートのダイアグラム上でカーソルをドラッグして、標準的なトランスフェクションに使用するウェル数を選択してください。

各実験サンプルについて、プールするために最低3つのウェルを使用してください。次に、プログラムコードを入力し、パート1でFを選択し、パート2のプルダウンメニューから1 68を選択します。続いて、ソリューションボックスからmonocyte humanを選択し、コントロールオプションでstandardを選択して、適用をクリックします。

非トランスフェクションコントロールを含めるには、ダイアグラムから追加のウェルを選択する必要があります。次に、コントロールオプションから「no program control」を選択し、再度「apply」をクリックします。ヌクレオフェクション溶液を混合した後、室温に戻してください。

ここに示す正しい向きで、必要な数のnucleo veteモジュールをnucleo VETEプレートに配置します。まず1番目のモジュールを1列目と2列目に挿入し、以降のすべてのチューブに対しても同様に行います。トランスフェクション用に、1ウェルあたり500,000 cellsとなる十分な量のDCSを細胞培養フラスコから50 milliliterチューブに移します。細胞を4°Cで400 G、10分間遠心分離し、上清を慎重に取り除きます。次に、チューブにnuclear affection solutionを加え、数回ゆっくりとピペッティングしてDCSを再懸濁します。

次に、実施する特定の処理に従ってEPエンドルフ管にラベルを貼り、再懸濁した細胞をラベル付きの各管に分注します。適切なEPエンドルフ管に、細胞500,000個あたり0.25 µgの最終濃度となるようにsiRNAを加え、ピペッティングにより細胞懸濁液を混合します。非標的siRNAを、非トランスフェクション対照サンプルに使用してください。

次に、あらかじめプログラムされた実験レイアウトに従って、SI RA DC細胞懸濁液を20 µLずつNucleoVetモジュールにピペッティングし、液体がウェルの底に届くようにします。NucleoVetプレートに蓋をし、硬い表面に数回軽く叩きつけて気泡を取り除き、DCをトランスフェクションします。準備したNucleoVetプレートをNucleoEffector 96ウェルシャトルトレイに挿入します。その後、[Upload]および[Start]ボタンをクリックします。

ディスプレイでトランスフェクション工程の進行状況を確認します。緑色の背景に黒い十字が表示されている場合は、そのウェルのトランスフェクションが成功したことを意味し、赤色の背景に黒いバーが表示されている場合は、細胞のトランスフェクション中に失敗したことを意味します。トランスフェクション工程の完了後、あらかじめ温めておいたDC増殖培地を準備し、プレートを取り出して、各ウェルに80 µLの温めたDC増殖培地を加えます。

マルチチャンネルピペットを使用し、プレートを37°C、5% CO2で10分間インキュベートします。インキュベーション中に、事前に加温したDC増殖培地100 µLを、nucleo cuvetteプレートの配置と同じ向きでマトリックスチューブに分注します。インキュベーション後、nucleo CVE内の細胞懸濁液100 µLすべてを、あらかじめ準備したマトリックスチューブに転移させます。

次に、トランスフェクションが起こらなかったチューブを取り除き、廃棄します。最後に、マトリックスチューブを24時間または任意の時間の間インキュベートします。各インキュベート中のマトリックスチューブに対応するeinorチューブにラベルを貼ります。

その後、マトリックチューブをインキュベーターから細胞培養フードへ移し、各実験サンプルのマトリックチューブを、あらかじめラベルを貼ったeend dfsに集めます。次に、eend DPHチューブを卓上遠心機で10分間、400 Gで緩やかに遠心分離して細胞をペレット化します。上清を除去し、MOI 1のニューカッスル病ウイルス（NDV）を含む無血清増殖培地で細胞を緩やかに再懸濁します。

エピエンドルフィンを無菌的に被覆し、その後、チューブを45分間インキュベートします。このインキュベーション期間の後、900 µLのDC増殖培地を加え、チューブをさらに8〜10時間再インキュベートします。これにより、トランスフェクションおよび感染させたDCを回収します。

前述と同様に、卓上遠心分離機でエイナーチューブを遠心分離して細胞をペレット化し、上清を除去します。単球由来樹状細胞（monocyte DCs）に、RIG-Iを標的とするsiRNAまたは非特異的なコントロールsiRNAを導入し、プラス（+）で示したサンプルにはNDVを感染させ、マイナス（-）で示したサンプルには感染させませんでした。定量的RT-PCRにより解析した結果、転写レベルでRIG-Iのノックダウンが75%認められました。同様に、インターフェロンβの発現低下が観察されました。また、インターフェロンシグナル伝達経路におけるRIG-Iの下流エフェクターの減少も認められました。さらに、非感染のコントロール導入細胞では、インターフェロンβの発現は検出されませんでした。

一方で、MXAおよびインターフェロンβ下流応答遺伝子の反応は最小限でした。ここでは、前図と同様に、RIG-Iを標的としたsiRNAを用いてDCSに実施した2回目のトランスフェクションのデータを示しています。ただし、すべての細胞にNDVを感染させ、さらに未切除の単球由来DCSを用いた追加のコントロールを組み込んでいます。

遺伝子サイレンシングの結果は、前図で観察されたものと同様でした。RGAに対するウェスタンブロット解析により、この遺伝子のタンパク質発現が完全に抑制されていることが明らかになりました。レーン1および2は、未切除細胞のライセートのデータを示しています。

レーン3および4はグローirnaを導入した細胞のライセートを示し、レーン5および6はRIG Iを標的とするS Irnaを導入した細胞のライセートを示しています。習得すれば、この手法は多くの遺伝子の同時ノックダウンを含め、1時間で完了させることができます。