同系ゼブラフィッシュにおける限界希釈細胞移植を用いた腫瘍増殖細胞の頻度を定量化

限界希釈細胞移植アッセイは、実験動物モデルにおける自己複製能を評価するためのゴールドスタンダードです。本デモンストレーションでは、1細胞期の同系ゼブラフィッシュ胚にrag2 MICおよびRAG2 GFPを注入し、蛍光標識されたT細胞急性リンパ性白血病を発症するトランスジェニックゼブラフィッシュを作製します。生後60日までに、ゼブラフィッシュから一次白血病細胞を分離し、その後、蛍光活性化細胞分取法を用いて精製します。

次に、細胞を限界希釈法により成魚ゼブラフィッシュの腹腔内に移植し、最大90日間、魚の腫瘍成長を観察します。最後に、extreme limiting dilution analysis（極限希釈解析）統計ソフトウェアプログラムを用いて、元の腫瘍内における白血病増殖細胞の頻度を定量化します。限界希釈細胞移植解析により、研究者は腫瘍塊の大部分に含まれる自己複製細胞の数を正確に評価することができます。

がんの形成を促進し、最終的に再発の原因となるのが、これらの自己複製能を持つ細胞です。ゼブラフィッシュモデルを用いて限界希釈移植アッセイを行う主な利点は、1回の実験で多くの魚に移植できるため、自己複製能を持つ腫瘍播種細胞の頻度を決定する際の精度が高まることです。この手法は、T細胞急性リンパ性白血病における腫瘍播種細胞に関する知見を提供します。

本手法は、他のゼブラフィッシュがんモデルの理解にも適用可能です。本日は、当研究室のフェローであるJessica Blackburnと、熟練したテクニシャンであるSally Liuが手順を実演します。Rag2 CMおよびRAG2-GFP DNA構築物を直線化するために、各プラスミド10 µgを制限酵素NotIで37 °Cにて一晩消化します。フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿後、各プラスミドを20 µLの水に懸濁します。

各消化済みプラスミドを1:1、1:5、1:10に希釈し、20 µL、10 µL、および5 µLの高レンジDNAラダーとともに1%アガロースゲルで電気泳動を行い、DNA濃度を決定します。次に、CG1系統のゼブラフィッシュ胚に注入するため、DNAを最終濃度60 ng/µLまで希釈します。ゼブラフィッシュ胚に、30 ng/µLのrag2 CM 250 nLおよび30 ng/µLのDNAを注入します。

2つのGFPをゼブラフィッシュ胚の1細胞期に注入し、DNAが卵黄ではなく細胞に直接導入されるよう慎重に行います。注入した胚は28.5 °Cで保存し、24時間後に死死胚を除去します。出生後5日目に、注入から約28日後に個体を大型タンクに移します。ペトリ皿に入れた25 mLの魚用飼育水に、4 ng/mLのtricaineを200 µL添加し、ゼブラフィッシュ幼魚を麻酔します。

落射蛍光顕微鏡を用いてGFP蛍光を検出し、蛍光標識されたTALLの発達を幼魚で確認します。分析において白血病の魚を見逃さないよう、腫瘍陽性の幼魚を陰性の個体から分離します。陰性の幼魚については、腫瘍がより大きく成長した後の後のタイムポイントで再 examination することが可能です。落射蛍光顕微鏡を用いて、少なくとも週に1回、蛍光標識された白血病魚を観察し、腫瘍の成長を追跡します。

GFP陽性の白血病細胞が個体の50%以上に広がった時点で、9 mLの魚飼育水を入れたペトリ皿に、4 ng/mLのTrica Sを1 mL添加して魚を安楽死させます。その後、1 mLの5%胎児牛血清含有0.9 X PBSを入れた新しいペトリ皿に魚を移し、カミソリで魚をすり潰し、ピペッティングして大きな細胞塊を解離させます。次いで、細胞を40 µmのメッシュストレーナーに通して、50 mLチューブに回収します。

500 µLの細胞を4 mLポリスチレンチューブに分注します。死細胞を標識するために、1 mg/mLのプロイジウムヨードを1 µL加え、ボルテックスした後、細胞を氷上で保持します。また、移植時に腫瘍細胞のキャリアとして機能する正常血液細胞を回収するため、野生型CG1魚を準備します。50 mLチューブに0.9X PBS中5% FBSを4 mL加え、全量を5 mLにします。

正常血球を数え、0.9x PBS中の5% FBSを用いて3 × 10⁵ cells/mLに希釈し、96ウェルプレートの各ウェルに100 µLずつ分注する。フローサイトメトリー（FACS）を用いて、GFP陽性かつPI陰性の腫瘍細胞を、規定の用量の血球を含む96ウェルプレートにソートする。さらに、正常血球を含まないウェルに10,000 cellsをソートし、FACSで再解析してソートした細胞の純度と生存率を評価する。96ウェルプレートを2000 ×gで10分間遠心分離し、細胞をペレット化する。

snatを95 µL取り除き、残りの5 µLで細胞を再懸濁します。26.5Gのマイクロシリンジを用いて、この細胞懸濁液を60日以上の成体同系ゼブラフィッシュの腹腔内に注入します。移植前にゼブラフィッシュを麻酔する必要はありません。

移植から約28日後、45匹の魚に10個の白血病細胞を、20匹の魚に100個の細胞を、7匹の魚に1000個の細胞を、そして5匹の魚に10,000個のTALL細胞を移植した。GFP蛍光を検出するため、励起波長485/20および蛍光フィルター530/25を用いたエピ蛍光顕微鏡で、レシピエントのゼブラフィッシュを観察した。

注入した魚の総数に対する陽性魚の数を記録します。最大90日まで14日ごとに魚を再検査し、陽性魚の数を記録してください。腫瘍陽性の魚が増加した際に行います。

トリフルオロエタノール（TCA）の過剰投与により動物を安楽死させ、結果をテーブルに入力し、ウェブベースの極限希釈分析ソフトウェアにデータをアップロードして、一次TALL CG1株内の自己複製能を持つ白血病細胞の頻度を決定します。胚にRAG2-cmicを注入し、RAG2-GFP幼魚を一次TALLについてスクリーニングしました。先行研究と同様に、28日後には注入された魚の約5%が胸腺内にGFP陽性T細胞を持ち、これらの魚の100%が白血病を発症します。ここでは、罹患した65日齢の動物から蛍光標識されたTALL細胞をソートし、極限希釈細胞移植アッセイに使用しました。まず、単一細胞を選択するためにゲートを設定しました。

次に、プロピジウムイオダイド陰性細胞を選択しました。そして最後に、ソートのためにGFP陽性の白血病細胞のみを選択するゲートを設定しました。TALLを移植した魚の28日目のこの例では、注入部位付近にGFP陽性細胞の領域として初期段階の腫瘍が認められました。

一部のTLS（腫瘍幹細胞様細胞）はより進行しており、今回の実験では腹腔を満たすまで増殖していましたが、220匹以上の個体に移植を行いました。これは1人で数時間以内に容易に完了させることができます。eldaソフトウェアを用いたデータ解析の結果、平均して135個のT all細胞に1個の割合で、自己複製能を持つ白血病増殖細胞が存在することが示されました。このビデオを視聴することで、同系ゼブラフィッシュの腹腔内へ腫瘍細胞を限界希釈移植する方法、および得られたデータを用いて特定の腫瘍内の腫瘍増殖細胞の頻度を決定する方法について、十分に理解できるはずです。

遺伝子改変動物を用いたさらなる研究により、これらの腫瘍播種細胞の自己複製を制御するメカニズムの解明に寄与することが期待されます。