CD71/TER119フローサイトメトリーアッセイを用いてマウス赤血球前駆細胞の同定と解析

本実験の全体的な目的は、マウスから採取したばかりの組織内で赤血球前駆細胞を直接的に同定することです。これにより、これらのマウスの造血システムが変化している時期における、前駆細胞の分子特性を研究することが可能になります。例えば、胚発生期や低酸素ストレスへの応答時において、まずマウスの胎児肝臓、あるいは成体の脾臓または骨髄から造血組織を単離し、単一細胞懸濁液へと解離させます。

次に、細胞表面マーカーであるCD 71およびTER 119に対する抗体、および必要に応じて細胞生存率や細胞周期の状態を測定するためのその他のマーカーで細胞を標識します。その後、標識した細胞懸濁液をフローサイトメトリーアナライザーで解析し、成熟の異なる段階にある特定の赤芽球サブセットを同定します。これらの特定のサブセットは、セルソーティングによって精製することが可能です。続いて、それぞれの赤芽球成熟サブセットに対して、細胞および分子レベルの解析を行うことができます。

新鮮に単離した造血組織において、特定の成熟段階にある赤芽球を直接的に同定できる能力により、生理的な皮質内での細胞研究が可能になります。したがって、本手法を用いることで、異なる成熟段階にある高分化赤芽球がin vivoでどのように反応するかを研究することができます。マウスに刺激を与えると、赤血球造血速度が加速します。

例えば、高地を模した低酸素条件や、ホルモンであるエリスロポエチンの投与などが挙げられます。我々はマルチパラメーターフローサイトメトリーを用いて、複雑な組織環境の中から赤芽球を特定し、そのシグナル伝達、生存、および細胞周期の状態を同時に解析します。また、新鮮な組織から特定の成熟段階にある赤芽球を直接分取し、その遺伝子発現レベルやクロマチン状態、その他の分子機能を探究することも可能です。

マウスの定常的赤血球造血は、成体マウスの脾臓および骨髄で起こります。そのため、安楽死させたマウスからこれらの組織を採取します。マウスを安楽死させた後、心穿刺によりEDTAまたはヘパリン血清採取チューブに採血します。この血液は、後でヘマトクリット値、網状赤血球数、またはCBC分析に使用します。

採取した脾臓と大腿骨を、冷えた染色緩衝液を含む別々のチューブに入れます。必要に応じて、採取した組織を氷上に保持します。脾臓の重量を量ります。

赤血球生成ストレス応答が生じているマウスでは、脾臓重量が著しく増加する傾向にあります。その後、採取した組織から、マウス胚で以前に示された手順に従って脾細胞および骨髄細胞を調製します。定常的な赤血球生成は、胚発生12.5日から15.5日の間に胎児肝臓で行われます。

妊娠12.5日から14.5日の胎児肝細胞を得るため、妊娠日数を確定させた妊娠マウスを準備します。妊娠マウスを安楽死させ、子宮角を氷上のペトリ皿に取り出します。冷やした培養液または染色バッファーを用います。

胚齢12.5日以下から胎児肝臓を摘出する場合、および子宮から胚を取り出す場合には、解剖顕微鏡が必要です。まず、各胚を子宮角から分離させます。次に、子宮壁を慎重に切除し、羊膜嚢内の胚を放出させます。

羊膜をそっと剥がします。胎児肝臓は、非常に小さい心臓の下に位置する、腹部の最大の赤い組織です。胎児肝臓を摘出するには、ピンセットで肝臓の両側から胚を固定し、肝臓を腹部から培地中へとそっと押し出します。

肝臓を新鮮な染色バッファーが入ったチューブにそっと移します。すべての胎児肝臓の解剖と新鮮な染色バッファーへの移送が完了した後、ピペッティングによって肝臓を機械的に分散させ、分散した細胞を40 µmのナイロンメッシュスクリーンでろ過します。その後、遠心分離によって細胞を2回洗浄し、上清を捨てて染色バッファーで再懸濁します。

2回目の洗浄後、細胞をトリパンブルーで染色し、血球計数器を用いてカウントします。E 13.5の胎児肝臓には約10⁷個の細胞が含まれています。フローサイトメトリー分析用に、細胞を200 µLのサンプルあたり1～2 × 10⁶個の濃度で再懸濁します。

本ビデオプロトコルでは、フローサイトメトリーのための抗体染色の手順を胎児肝細胞のみを用いて実演します。この手順を開始するために、マウス細胞のFC受容体をブロッキングするための精製ウサギIgG、CD 71 FETR one 19 PE、および細胞表面タンパク質fastに対する抗体を含む一次抗体染色プレミックスを調製します。チューブを2〜3回反転させて抗体溶液を穏やかに混合し、あらかじめ調製した胎児肝細胞サンプルに一次抗体染色プレミックスを200 µL加え、ピペッティングで穏やかに細胞を再懸濁させます。

次に、これら6つのコントロール細胞サンプルを準備します。細胞の背景自発蛍光を確認するために染色バッファー中に細胞を保持した未染色サンプル、および、各チャネル間のスペクトルの重なりを補正するための、プロトコルで使用される各抗体または色の単色サンプル（本実験では、TUR one 19 PE CD 71 fz fast、biotin、およびstreptavidin A PC）を用意します。また、fast biotinの真の背景を確認するためのfluorescence minus one（FMO）コントロールとして、fast biotin以外のプロトコル内のすべての色または抗体で染色したサンプルを準備します。サンプルおよび関連するコントロールを一次抗体染色液に入れ、氷上で暗所にて45分から1時間インキュベートします。

インキュベーション終了後、各サンプルチューブに3 mLの染色バッファーを加え、4 °C、約400 ×gで3〜5分間遠心分離して細胞を洗浄します。次に、PCでstrep avidを適用し、チューブを氷上で30〜45分間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、一次抗体染色時と同様に細胞を洗浄します。

最後に、死細胞を除外するため、細胞膜非透過性のDNA染色剤であるseven a a dを含む染色液で細胞を再懸濁します。これでサンプルをフローサイトメトリー解析に供することができます。本手順で最も困難な点は、赤芽球サブセットを確実に同定するための、フローサイトメトリーイベントの正確なゲーティング解析です。

適切なコントロールサンプルの準備を含む慎重な装置のセットアップ、スペクトルの重複に対する精密な補正、および死細胞、凝集塊、極小のイベントを除外するためのその後のゲーティングが必要です。データ解析の開始時に、未染色サンプルと単色コントロールサンプルを用いて、各色の組み合わせに対するスペクトル重複の補正を設定します。

この例では、FITCの蛍光がどのようにPEチャネルに漏れ込むか、また、コンペンセーション（補正）後にこのスペクトルのオーバーラップがどのように補正されるかを示します。まず、未染色コントロールを用いて、FITC陽性かつPE陰性の領域を定義します。次に、FITCの単色コントロールを用いて、PEチャネルへのスペクトルスピルオーバーを可視化します。

FlowJoソフトウェアを用いたデジタル補正により、PEチャンネルにおけるspillover fit E信号を最小限に抑えます。補正後、死細胞、凝集塊、および微小イベントを除去できます。凝集塊および細胞のダブレットは、前方散乱光（FSC）の高さ（height）に対して面積（area）をプロットし、狭い対角線上のゲート内にあるイベントを選択することで除去します。

DAPI（細胞非透過性DNA染料）陰性の細胞を選択することで、死細胞を除去します。DAPI陰性の生存細胞ゲートでは、前方散乱光が非常に低い核やデブリなどの極めて小さなイベントも同時に除外されます。次に、胎児肝細胞のゲーティング戦略について説明します。

採取したばかりの細胞をCD 71 TUR one 19および非赤血球系マーカーに対するZI標識抗体カクテルで標識しました。この例では、サンプルはすでにスペクトルのオーバーラップに対する補正が行われており、凝集細胞、死細胞、および極めて小さなイベントを除外するためにゲーティングされています。系陽性fitzy染色の色を除くすべての色を含むFMOサンプルを使用してfitzyヒストグラムをプロットし、系陰性細胞のゲートを定義します。次に、このゲートをZI標識系マーカーで染色した胎児肝細胞サンプルに適用します。

リネージ陰性細胞を選択し、Y軸にCD 71、X軸にTER 19をプロットします。これにより、細胞をS 0からS 5のサブセットに分ける準備が整います。Lin除去済みのS 0サブセットには、主にEPO依存性が生じる前のCFU-E能を持つ細胞が含まれています。

S1サブセットには、主に細胞周期のS期にあるEPO依存性のCFU-E細胞が含まれます。S2サブセットの細胞はコロニー形成能を失い、ヘモグロビンの発現が始まっています。S3サブセットの細胞は主に好塩基性赤芽球であり、S4およびS5サブセットには後期赤芽球が含まれます。ここでは、CD71およびTER119に対する抗体、ならびに死受容体で処理および標識された脾臓細胞からのデータ取得後の解析戦略を示します。

一つは取得したすべてのイベントを示しており、対角ゲートはダブレットやそれ以上の凝集塊を除いた、単一細胞である可能性が高いイベントを表しています。このゲート内の細胞について、こちらのヒストグラム2でさらに解析を行います。核やデブリである可能性が高い非常に小さなイベントは除外されます。

ゲートされた細胞はヒストグラム3に示されており、膜透過性を持つアポトーシス細胞である可能性が高いDAPI陽性細胞は、以降の解析から除外されています。ヒストグラム4は、その結果得られた生存脾細胞の集団を示しています。pro eGateにはCD71 highおよびTER19 Intermediate細胞が含まれており、TER19 high細胞についてはヒストグラム5でさらに解析を行います。

ここでは、CD 71高発現細胞が、未熟で面積の大きいA赤芽球と、より小規模で成熟したB赤芽球に細分化されます。最も成熟した赤芽球サブセットはCです。TER 19およびCD 71と同時に適切な抗体を添加することで、これらの各サブセットにおける細胞表面タンパク質の発現を同時に測定できます。染色ヒストグラム6は、基底状態のマウスおよび単回投与のEpoを注射したマウスにおいて、特にAサブセットにおけるデスレセプターFasの細胞表面発現を示しています。

結果は、EPOがこの領域における速い発現を抑制することを示している。各サブセットの細胞について、細胞内タンパク質のin vivo発現量や細胞周期の状態を測定することも可能である。この代表的な細胞周期解析では、マウスにBRDUを腹腔内投与し、30〜60分後に骨髄を採取した。

CD 71およびTER one 19の染色に加えて、複製中のD-N-AへのBRDU取り込みについても細胞を染色しました。BRDU陽性細胞は、細胞周期のS期にあります。間期の細胞はBRDU陰性であり、G one期またはG two M期に分類することができます。DNAD seven A A Dを用いることで、PRO E area A A BおよびA ECサブセットのそれぞれから細胞を分取することが可能です。

ここでは、細胞サイズの縮小、核凝縮、およびヘモグロビン発現を反映した褐色色の増加を伴う連続的な成熟を示すサイトシン標本に提示されています。最後に、E 13.5 胎児肝臓における S3 サブセットの代表的な細胞周期解析をここに示します。妊娠マウスに BRDU を注入しました。

胎児肝臓を採取し、30〜60分後に固定、透過処理を行い、CD 71、TER 1-19、およびBRDUに対する抗体で染色しました。S3細胞の細胞周期の状態を解析し、S期細胞をBRDU陽性として同定し、DNA染料である7-AADによる染色でDNA量を定量しました。

本稿で述べるサイトメトリー的手法により、細胞表面マーカーやその他のタンパク質の発現、細胞生存、ホスホ特異的抗体を用いた細胞シグナル伝達、および細胞周期の状態といった細胞機能を同時に解析することが可能になります。したがって、赤芽球という異なる成熟段階における広範な刺激に対する分子応答や、遺伝子変異の影響を調査することができます。なお、フローサイトメトリーによる成熟サブセットは、細胞表面マーカーの発現と前方散乱光に基づいて定義されることに留意してください。

一般的に、各サブセットの細胞は、幅広いマウスモデルにおいて同様の形態学的赤芽球段階に対応することがわかりました。ただし、新しいマウスモデルを検討する際には、この点を確認することを推奨します。各サブセットから細胞を分取し、その形態を観察してください。また、各サブセットの細胞は、RNA解析やトランスクリプトーム解析のために分取することも可能です。分取実験では、細胞へのせん断ストレスを最小限に抑えるため、低い分取圧力と広いノズル幅を使用してください。

また、各ソーティング実験の後には、細胞の純度と生存率を確認することを推奨します。最後に、特定のサブセットの頻度に変化が検出された場合、それが当該サブセット内の細胞数の真の変化によるものか、あるいは他のサブセットの変化によるものかを判断することが重要です。したがって、サブセットの頻度を測定することに加えて、各サブセットにおける細胞の絶対数を常に測定する必要があります。