生体内イオン濃度の測定のための蛍光ナノ粒子

本実験の全体的な目的は、in vitroおよびin vivoアプリケーション向けのナトリウムナノセンサーを作製することです。これは、ナノセンサーの構成成分を含むオプト混合物を調製することによって達成されます。第2ステップとして、水溶液中で界面活性剤を超音波処理して均一に分散させ、そこにオプトを添加することでナノセンサーを形成させます。

次に、超音波処理を行いながら、オプト混合物を水溶性界面活性剤混合物に添加し、溶液中でナノセンサーを形成させます。このビデオでは、センサーの応答が調整可能であることを示しています。これらのセンサーは心筋細胞に微量注入できるほか、マウスへの皮下注射も可能です。

蛍光指示薬などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、センサーを生理学的環境に適合するダイナミックレンジに調整でき、より広範な分析物を測定できるほか、定量分析のためにレシオメトリック測定が行える点にあります。一般的に、この方法に不慣れな方は、センサー作製後にそれを生物学的環境に導入することに困難を感じる場合があります。オプトセンサーを作製する前に、記載のプロトコルに従って、dry sodium ion four x dry sodium TFPBおよびchromo four threeのストック溶液を準備しておく必要があります。

ドラフトチャンバー内で、すべての材料を1.5 milliliterのガラスバイアルに合わせます。テフロンコーティングのスクリューキャップを閉め、すべてのPVCが溶解するまでバイアルを緩やかにボルテックスします。溶液は赤色になります。

4 gのガラスバイアルに、10 mg/mLのPeg lipidを100 µL加えてナノセンサーの作製を開始します。次に、10 mMのhippiesなどの目的の水溶液を4 mL加えます。

ラボジャッキを使用して、超音波ホーンの先端をバイアル内に7 mmまで浸し、低出力で30秒間ソニケーションを行います。0.6 mLチューブに、ピペットを用いてオプト材料50 µLとジクロロメタン50 µLを加え、均一に混合させます。次に、3分間のソニケーションを開始します。

ソニケーションを開始すると同時に、ピペットチップを浸し、オプト混合液 100 µL を一度に素早く均一に注入して加えます。pH が 7 を超えた場合、および溶液から残留 THF およびジクロロメタンを除去するためのナトリウムがない場合は、溶液が青色に変化します。ソニケーションチップの深さを 2 mm に移動させます。

残り3分が経過すると、溶液は不透明になります。ソニケーションが完了したら、ナノセンサー溶液を5 mLシリンジで吸い上げます。フィルターを取り付け、ナノセンサー溶液をスクリューキャップ付きのガラスバイアルに分注します。

まず、ナノセンサーの感度を測定するために、ナトリウム濃度を段階的に上昇させた10種類の溶液を調製します。0 Mおよび1 Mのナトリウムストック溶液を50 mLコニカルチューブ内で混合します。次に、光学底96ウェルプレートの1列につき3つのウェルに、各濃度のナトリウム溶液を100 µLずつ加えます。

次に、調製したばかりのナノセンサーを各ウェルに100 µLずつ加え、プレートをマイクロプレート蛍光光度計にセットし、使用する発色団に最適な励起・蛍光・カットオフ波長を入力します。測定波長の選択はアプリケーションによって異なります。これらの波長を設定することで、細胞内の高速ダイナミクスの測定やノイズの低減が可能になります。

α値を求めるには、570 nmにおける強度の比を、670 nmまたは680 nmにおける強度で除します。α値をナトリウム濃度の対数に対してプロットします。なお、ナトリウム濃度0の対数は-1として設定します。

次に、応答にシグモイド曲線を当てはめ、その曲線からα値が0.5となるナトリウム濃度を算出します。これは、センサーが最適に応答するナトリウム濃度を表しています。この情報を基に、optoにおけるsodium iono four x sodium TFPBとchromo iono four threeの比率を調整し、最適なナトリウム濃度を持つナノセンサーを作製します。

例えば、4つの10のナトリウム量のみが異なる、異なる光学的処方を表す5種類のナノセンサーセットのヒューロー応答曲線を示します。細胞内イメージングを行う場合は、細胞培地をTyro溶液のような透明な培地に置き換え、細胞をイメージングチャンバーに移動させます。次に、水に5 mg/mLのグルコースを溶解して調製したナノセンサー溶液を、引き伸ばしたガラスピペットに充填します。

次に、ピペットをマイクロマニピュレーターに取り付け、圧力制御注入システムに接続します。ピペットを細胞の上にまで下げ、細胞質内に挿入します。膜を貫通させるために、マニピュレーターホルダーを軽く叩く必要がある場合があります。

数百ピコリットルのナノセンサー溶液を注入し、速やかにピペットを抜きます。麻酔チャンバーを用いて、イソフルランでCD-1ヌードマウスを麻酔させます。麻酔が完了したら、マウスを消毒済みのイメージングチャンバーに入れます。

次に、滅菌済みの31ゲージインスリン用注射器に、10 millimolar PBSで調製した適切なKD値を持つナノセンサーを10 µL充填します。ピンセットを使用して、すべての気泡を取り除いてください。注射部位となるマウスの背中の皮膚を、皮膚を掴みながら小さくつまみ上げます。

針の斜面を上に向け、皮膚と平行になるようにシリンジを刺入します。次に、シリンジのプランジャーを後方に引き、針が血管に入っていないことを確認します。背圧を最小限に抑えるため、針を左右にゆっくりと動かし、皮膚内にポケットを作ります。

次にセンサーを注入し、ゆっくりとシリンジを抜きます。注入部位を軽く圧迫し、注入部位から漏れ出した溶液を拭き取ってください。通常、背中に沿って等間隔に6か所注入します。

異なるマウスで実施する場合は、疾患の伝播および交叉汚染を最小限に抑えるため、針を交換してください。注射後、ナノセンサーの励起・蛍光スペクトルに密接に一致するフィルターセットを使用して、明視野像および蛍光像を取得します。これにより、皮膚の自家蛍光も最小限に抑えられます。

これらの新生児心筋細胞をカバーガラス上で培養し、ナトリウムナノセンサーを注入しました。この蛍光画像は639 nanometerの励起波長で撮影したものです。こちらは同じ細胞の明視野画像であり、最後はこれら2つの画像の重ね合わせです。

センサーの凝集が一部で見られますが、細胞の形態は正常です。センサーは細胞質全体に拡散しており、核への蓄積は見られません。この明視野像と蛍光像のオーバーレイ画像は、ヌードマウスの皮下組織にナトリウムナノセンサーを9箇所に皮下投与した様子を示しています。

適切に行えば、ナノセンサーの作製は数分で完了し、可逆的なリアルタイムの分析物変動を測定するあらゆる研究に応用できます。このビデオを視聴することで、生物学的環境における定量測定のために、ナノセンサーを細胞内または皮下空間に導入する方法について十分に理解できるはずです。