アクティブな細胞培養のための形状記憶ポリマー

この手順の全体的な目的は、経時的にトポグラフィーが変化する基質中で細胞を培養することです。これは、まず形状記憶ポリマーを記憶可能な永久形状にプログラムすることで達成されます。その後、形状記憶ポリマーを一時的な形状にプログラムし、そこに細胞を播種します。

手順の最終ステップは、温度を上げて形状記憶ポリマーを永久形状に復帰させることであり、最終的に蛍光顕微鏡を通じて細胞の挙動の変化を示す結果を得ることができます。こんにちは、パット・マザーです。私はシラキュース大学で生体医工学および化学工学の教授を務め、シラキュース生体材料研究所の所長をしています。

細胞を伸展させるための市販装置やカスタム装置と比較して、本手法の主な利点は、単一のポリマー系において、細胞に多種多様で複雑な歪みを負荷できることです。私はジェイ・ヘンダーソンです。生物医学・化学工学の助教であり、シラキュース生物材料研究所のメンバーです。

この手法は、細胞が物理的環境の動的な変化にどのように反応するかといった、メカノバイオロジー分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。私はケビン・デイビスです。シラキュース大学の生物医学工学および化学工学部の博士課程学生です。この手法は2Dのメカニカルバイオロジーに関する知見を提供しますが、組織工学用の3D形状変化スキャフォールドなど、他のシステムにも応用可能です。

本手順を開始する前に、ガラススライド、厚さ1 mmのテフロン製スペーサー、およびアルミニウムプレートを用いて、カスタムキュアリングチャンバーを準備します。小型バインダークリップでチャンバーを固定し、18ゲージの針を用いて、テフロン製スペーサーの穴からNOA 63をチャンバー内に注入します。その後、チャンバーを125 °Cに設定したホットプレート上に置きます。

チャンバーの加熱後、温度が均一になるまで5分間待機します。ガラス表面から6.5 cmの距離にUVランプを配置し、NOA 63を20分間硬化させます。NOA 63がまだ温かいうちに、カミソリ刃を用いてチャンバーから取り出します。

次に、形状記憶ポリマーを125 °Cのホットプレート上に直接置き、UVライト下で3時間40分間ポストキュアします。NOA 63の形状記憶特性を評価するため、カスタムパンチを用いてキュア後のフィルムを熱プレスし、ダンベル型試験片を作製します。最後に、引張治具を備えた動的機械分析装置に試験片をロードします。

装置を荷重制御モードに設定し、本ビデオに付随する書面プロトコルに従って試験手順をプログラムします。この手順の結果、等温硬化させた形状記憶ポリマー（SMP）フィルムが得られます。モジュラスを低下させ、切断しやすくするために、等温硬化SMPをホットプレートに置き、温度をガラス転移点より高く設定します。等温硬化SMPフィルムから個々のサンプルを作製します。

カミソリを用いて、sおよびpフィルムを目的のサンプルサイズに切り出します。一時的な形状は、いくつかの異なる方法で固定することが可能です。ここでは、加熱および冷却が可能なプレートを備えた卓上油圧プレス機を使用して、一時的なトポグラフィーをエンボス加工します。

まず、PLAの温度をガラス転移温度（tg）以上に設定します。本デモンストレーションでは、ビニールレコード上にエポキシ樹脂を硬化させ、平行溝の一時的な形状を形成してエンボッサーを作成しました。エンボッサーは他の材料や異なるトポグラフィーで作成することも可能ですが、NOA 63よりも剛性が高い必要があります。

エンボス加工温度にて、sおよびpサンプルをエンボッサーの上に裏向きに配置します。次に、サンプルとエンボッサーをプレス機に入れます。加熱PLAとサンプルの間に接触を持たせるため、約100 kilo pascalsのプリロードをかけ、サンプルが均一な温度に達するまで約5分間保持します。

温度が均一に到達したら、サンプルに1〜6 MPaの圧力を加え、1分間保持します。これによりSMPが破断します。より大きな応力を加えた場合。

より小さな振幅のトポグラフィーを導入するために、より小さな応力を加えます。加圧後、プレスプレートの水冷機能を用いて、温度をTG以下まで下げます。温度がtg以下になったら、活性細胞培養実験を開始する前に、印加した力を取り除きます。

バイオセーフティキャビネットのUVライトを使用して、サンプルの滅菌を行います。蓋のない滅菌ディッシュにサンプルを裏向きに並べ、UVライトを6時間点灯させます。その後、サンプルを新しい滅菌ディッシュに移し、表面を上にして配置します。

UVライトをさらに6時間点灯させます。細胞を播種する前に、サンプルを比較的安定した状態に平衡化させる必要があります。サンプルを96ウェルプレートに移し、150 µLの完全増殖培地を加えます。

1ウェルあたりの培地量。希望する部分的な回復に至るまで、プレートを30°C、5%CO2のインキュベーターに入れます。本デモンストレーションでは、細胞を整列させるのに十分な振幅を得るため、サンプルを30時間インキュベートします。

部分的な回復が達成されたら、サンプルに細胞を播種できます。サンプルを新しい96ウェルプレートに移します。次に、各サンプルに細胞懸濁液を150 µLずつ加えます。C3 H 10 t and a half。

ほとんどの胚性線維芽細胞は、1 mLあたり20,000個の密度で使用されます。細胞を単離させるため、30 °Cで9.5時間インキュベートし、一時的なトポグラフィーへの細胞の接着と伸展を促します。次に、サンプルを回収して染色および蛍光イメージングを行い、移行前の細胞形態を評価します。

この材料は、UVおよび可視光域の大部分において自家蛍光を示します。背景ノイズを低減するため、スペクトルの遠赤色端にあるAlexa Fluor 647などの蛍光色素が推奨されます。トリガーした試料を回復させるには、プレートを37 °Cのインキュベーターに移し、さらに19時間培養してください。これにより、材料が回復し、細胞が新しいトポグラフィーに合わせて形態を適応させることができます。インキュベーション後、フィラメント状アクチンイメージング用のphalloidinなどの適切な染色剤を適用してください。

最終ステップとして、細胞をイメージングすることができます。ここに示されているのは、単一のNOA 63硬化物のバルク一方向形状記憶です。これを3回繰り返し、アスタリスクは実験的な硬化開始点を示しています。NOA 63は、優れた形状記憶特性を持つ透明なガラス状固体です。

本例において、材料を硬化させ、貯蔵弾性率の低下開始点から決定した均一なTgは51.1 °Cであった。ここで見られる歪みの低下は、測定されたTgで発生している。20 °Cの除荷後に、印加した4.7%の歪みの大部分が固定され、固定率は89.3%であった。その後、加熱中の比較的狭い温度範囲において、固定歪みが84.4%の割合で回復した。

すべての曲線がほぼ同一の経路を辿っていることから、形状記憶性能は3サイクルまで劣化しなかったことが示された。30 °Cにおいて、一時的なトポグラフィーの振幅は30時間かけて減少した。30 °Cにおいて。

振幅は、ここに示す時間0において約50%減少しています。その後9.5時間でさらに10%減少します。温度を37 °Cに上げて回復を誘発させると、使用したエンボッサーおよび4.9 MPaのエンボスストレスにおいて、振幅は9.5時間以内に初期振幅の0.5%まで減少します。

これは、13 µmの溝からほぼ平坦な表面への機能的な変化に相当します。このポリマーは、細胞培養条件下における30から37 °Cの温度範囲で回復します。これは培養液からの吸水によるものであり、水がポリマーを可塑化してtgを低下させるため、乾燥時のTGである51 °Cよりも低い温度での回復が可能になります。

活性細胞培養基材を用いて制御される細胞挙動の一例として、一時的に溝が形成された基材上での細胞骨格組織の変化が挙げられます。回復が誘導される前は、アクチンマイクロフィラメントが溝の方向に沿って配列しています。温度上昇によって回復すると、マイクロフィラメントが再編成され、ランダムな配向になります。

対照的に、静的な平面または静的な溝を持つコントロールサンプルは、温度上昇後も再編成されません。この手順を試みる際は、キュアリングチャンバーの形状、ポリマーの転移温度、歪みの固定方法、およびポリマー自体の組成をすべて調整することで、本手順に従い、自身の実験で目的とする転移を実現できることを留意しておくことが重要です。また、リアルタイムPCRなどの他の手法を用いることで、基質からの機械的刺激に反応して遺伝子発現がどのように変化するかなど、さらなる疑問を解消することができます。

この手法により、細胞メカノバイオロジー分野の研究者が、細胞骨格の再編成およびソフトマター物理学を2次元で調査することが可能となりました。私たちの研究にご関心をお寄せいただき、またご視聴いただきありがとうございました。