器官培養における神経雪崩のマルチ電極アレイの録音

この実験の目的は、皮質における臨界状態ダイナミクスの特徴である、正常な脳活動がニューロナルアバランシェ（神経雪崩）へと自己組織化される様子を研究することです。これは、冠状断面の層構造を持つ皮質スライスと、皮質へ発生上重要なドーパミン作動性入力を提供する中脳スライスを組み合わせることで実現されます。第二のステップとして、皮質と中脳の共培養物をマルチ電極アレイ（MEA）上で育成し、培養物内のニューロン活動の多点刺激および記録を可能にします。

次に、共培養物をカスタム設計のインキュベーター内で1〜2週間静置し、平坦化、拡大、およびMEA表面への接着を促進させます。このインキュベーターは、培養物を通常の空気と培養液に交互に曝露させるサイクルを備えています。その結果、時空間的な局所電位バーストがニューロンアバランシェへと自発的に自己組織化することが示されました。これは、MEA記録および、アバランシェサイズのべき乗則を特定するオフラインアバランシェ解析に基づいて導き出されました。

解離培養などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、システム神経科学的な側面があることです。多くの脳領域を共培養することができ、これらの多領域培養では、皮質層や投射系などの大きなスケールで正しい脳組織構造が構築されます。この技術の応用範囲は、単なるニューロンアバランシェの研究にとどまりません。

例えば、厳密に制御されたin vitro条件下で、ネットワークレベルでの刺激に対する反応を研究することができます。プラズマトロンビン混合液の適切な適用や、MEAへの組織の配置を習得するのは困難であるため、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。これらのステップでは、適切なタイミングと正確な温度勾配が必要であり、繊細なMEA表面に直接触れないようにすることが求められます。

記録用の滅菌可能な密封ガラスチャンバーを準備するには、まず、テフロン製プラスチックキャップ付きのネジ付きガラスシリンダーを、ネジの下端から約2 mmのところで切断します。これは、培養チャンバーを確実かつ密閉して閉じるために必要です。次に、ガラスリングを水で3回すすいで洗浄し、200 proofのエチルアルコール中で5分間煮沸します。

これらを脇に置いて乾燥させます。ガラスリングをMEA表面に取り付けるには、シリコン溶液が必要です。Cell Guard 180 4シリコンエラストマーキットを使用し、パートAとBを各15 milliliters十分に混合します。その後、気泡を除去するため、15分間静置します。

溶液を1 mLずつEloquaに分注し、今後の使用に備えて-20 °Cで保存します。次に、23 °Cのシリコン1 mLを細いゲージの針付きシリンジで吸い取り、ガラスリングの研磨されていない切断面に塗布して、MEAに接着させます。その後、ガラスリングをMEAの中央に配置し、密封性を高めるためにリングの外周にさらにシリコンを塗布します。

これをホットプレート上で約60°Cで1〜2時間硬化させます。次に、ラミナーフローフード内で、MEAチャンバーとチャンバーキャップを脱イオン水で3回、その後70%アルコールで3回すすぎ、滅菌します。最後のすすぎの後、チャンバーをアルコールに10分間浸漬させておきます。

続いて、チャンバーとキャップの内部をUVライトに10分間曝露させます。120 °Cで45分間オートクレーブ滅菌します。滅菌後、これらを乾燥させます。

次に、培養チャンバー内のMEA表面をポリDリシンでコーティングします。本実験で使用した新しいMEAはかなり親油性であるため、溶液を繰り返し滴下してコーティングを行ってください。その後、電極グリッドから溶液を吸引除去します。

保存および今後の使用に備え、キャップを取り付けてMEAチャンバーを密閉します。この手順により、約12個の共培養用の皮質およびVTA切片が得られます。操作は、生後1〜2日の健康な動物を用い、滅菌条件下でラミナーフローフード内で行ってください。組織採取に要する合計時間は1時間未満とする必要があります。斬首後、まず頭皮から皮膚を取り除くために、ハサミで左右に2箇所切開し、脳の摘出を開始します。

細い眼科用ハサミを用いて頭蓋骨を取り除き、小脳皮質接合部で正中矢状方向に1回、冠状方向に1回切り込みを入れます。これらの4つの頭蓋骨フラップを反転させて脳を露出させます。次に、鋭利なスパチュラを用いて、嗅球を前方から切断します。

次に、スパチュラを脳の下に四分の一間隔で差し込みます。脳を頭蓋骨からゆっくりと持ち上げ、急速冷却および一時保存用の冷却したガゼ溶液の中へ滑り込ませます。

上記の手順をさらに2つの脳で繰り返します。VTA組織を採取するため、脳を滅菌済みの乾燥したペトリ皿に移します。小型のスパチュラを使用し、各脳を約1 cm横にゆっくりとずらして、過剰な液体を除去します。

次に、カミソリを用いて、小脳の高さで冠状面に垂直に切断し、脳幹を除去します。次に、スライス操作中に脳を機械的に固定するため、アガロースブロックをマウンティングディスクに接着します。その後、小型スパチュラを用いて、ディスク上のアガロースブロックの数ミリ前方にシアノアクリレート系接着剤を薄く塗布します。この際、接着剤がアガロースに触れないように注意してください。

各脳を前頭極を下にして移し、固定します。前頭極が固定ディスクに接着されており、腹側が接着剤の残渣なくアガロースに接していることを確認してください。これにより、切断時の適切な機械的安定性が確保され、切断した切片を容易に回収することが可能になります。

次に、脳を固定したマウンティングディスクを、冷却したgaze溶液を満たしたバイブラートレイに慎重に浸し、固定します。その後、入念に洗浄したカミソリを用いて、最高振動周波数および比較的低速の前進速度で、中脳の厚さ400 $\mu$mの冠状切片を作成します。吸引バルブ付きの逆ピペットを用いて、VTAを含む切片を回収し、滅菌済みの冷却gaze溶液を満たした35 $\times$ 10 mmのペトリ皿に移し、皮質切片として保存します。前のスライス工程を繰り返しますが、皮質と小脳の間で垂直に切断し、4つの脳を前極を上にして固定します。

線条体のレベルから、厚さ 350 µm の冠状断切片を約3枚採取します。次に、カミソリの刃で作製したマイクロナイフを用い、実体顕微鏡下で、前頭前皮質および VTA を含む中脳領域の幅約 2 mm の冠状断切片を切り出します。組織切片は、冷却した gaze solution を満たした小さなディッシュにそれぞれ分けて回収します。

MEAチャンバーの第1ポジションに組織を固定し始めるには、まずステレオ顕微鏡下で、電極アレイに焦点を合わせて室温のMEAを配置します。次に、清潔で塵がなく、滅菌された電極アレイマトリックスの中央に、25 µLのプラズマ液を滴下します。小さなスパチュラを使用して、皮質およびVTAの切片をプラズマ液の滴の中へ慎重に滑り込ませます。

次に、MEAを冷却プレートの上に置き、視野を再調整します。約15秒間冷却した後、血漿ドロップに25 µLのトロンビンを加えます。その後、トロンビンを使用したピペットチップを用いて、血漿とトロンビンの混合液をMEA全体に小さな円を描くように慎重に広げます。

脆い電極アレイに直接触れないように注意してください。次に、皮質の背側縁がアレイの2列目の電極に沿うようにして、皮質をアレイ上にそっと配置します。これにより、発達中の表層が最終的にアレイの残りの部分を覆うことになります。

次に、VTAを皮質切片の腹側に隣接させて配置します。ここで、高湿度を維持するために、MEAチャンバーにキャップをして緩く閉じます。血漿トロンビンの凝固を促進させるため、MEA培養アセンブリをフード内の室温で約6分間静置します。

その間に、同様の手順を繰り返して、さらに3つの培養物を準備します。次に、1 ccシリンジに25G 5/8インチの針を装着し、培養チャンバーに培養液を600 µLずつ慎重に滴下します。その後、MEAチャンバーをしっかりと密閉し、MEA培養アセンブリをインキュベーター内のロッキング保存トレイに設置します。

in vitroで2日後、有糸分裂阻害剤を10 µL添加します。その後、in vitroで4日目、およびそれ以降4日ごとに、培養液の60%を交換します。正常な成長過程において、培養物は大幅に扁平化し、背側へわずかに拡大します。

浅層皮質層の発達により、健全な培養物は明視野において不透明な灰色色の組織として識別されます。対照的に、培養準備から約10〜12日後に現れる死滅した変性細胞の特徴である、明るく反射する小胞が見られれば、記録および刺激を行う準備が整ったことになります。記録セッションを開始するには、MEAを保管トレイから記録用ヘッドステージに移動させます。

局所フィールド電位（LFP）を記録するには、1～200 Hzのバンドパスフィルターを使用します。また、300～3000 Hzのバンドパスフィルターを用いて、マルチユニット活動を解析することも可能です。正常な自発活動は、大きさや持続時間が多様なバースト状に発生する傾向があります。

LFPとユニット活動の関係を調べるため、LFPのスパイク誘発平均を算出します。これらの皮質培養細胞では、刺激誘発活動を記録する場合、負のLFP偏向がニューロンのスパイクと相関します。まず、刺激発生装置を制御するソフトウェアを用いて、刺激の時間的波形と振幅を指定します。

有用な刺激パラダイムとして、双極矩形波を用いた電流制御電荷中性単回衝撃が挙げられます。次に、刺激の提示に使用する電極を選択します。典型的な刺激誘発LFP反応は、自発的な活動バーストと同様の外観を示します。

ブランキング回路は、刺激アーチファクトを低減し、アンプの飽和を防ぐために、刺激中にアンプを切り離します。刺激電極は刺激から回復するまでに数秒を要するため、応答活性の記録に使用することはできません。MEA上では、ある電極での活性が他の部位での活性を伴うことが多く、時空間的なクラスターとして現れる傾向があります。

同時に、このような活動期間中のLFPの典型的な波形を、各クラスターについて数秒の間隔で発生した3つのクラスターを重ね書きしてここに示します。負の標準偏差（sd）の倍数という閾値を越えるNLFPピークを抽出すると、1秒のウィンドウ内で複数の電極に負のLFP偏向が見られます。NLFPピークの時間形式による活動は、ドットの列がさまざまな電極におけるほぼ同時期のNPSを表すラスタプロットによって便利に可視化されます。この活動の時空間的な構成はかなり複雑です。

低い時間解像度ではほぼ均質に見えるカラムも、より高い時間解像度では個別のクラスターで構成されており、以下同様です。空間的、GEOTEMPORAL、およびLFPクラスターの出現は、皮質ネットワークにおいて高度に組織化されています。より具体的には、この組織化はニューロナルアバランチ（神経細胞アバランチ）においてスケール不変です。

これは、特定の時間分解能（Delta T）におけるクラスターサイズの確率を算出することによって実証されます。ここでのクラスターは、同じまたは連続するタイムビンで発生したNL FPSで構成されています。このようなクラスターのサイズを、クラスターあたりの総NFPS数またはクラスターあたりの統合NLFP振幅で表すと、クラスターサイズ分布はマイナス1.5に近い指数を持つべき乗則を示します。このビデオを視聴することで、神経活動の自己組織化を研究するために、脳組織を慎重に解剖し、マルチ電極アレイ上で培養する方法について十分に理解できるはずです。

これらの手法は、皮質ネットワークにおける自発活性と刺激誘発活性との関係を研究するためにも用いられてきました。