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エクソソーム(機能的な生体分子を運ぶナノサイズの膜結合小胞)は、ほとんどの細胞型によって活発に分泌され、in vitro細胞培養上清から単離できます。エクソソームを単離するには、まず、目的の細胞培養物から上清またはコンディショニング培地を採取します。コンディショニングされた培地には、エクソソーム、タンパク質、細胞破片、および小胞が含まれます。
培地を遠心分離して細胞破片をペレット化します。エクソソーム含有上清を収集し、細胞ストレーナーでろ過して、より大きな小胞を除去します。ろ過された培地の特定の量を新しいチューブに移します。次に、適切な濃度のスクロースと酸化重水素を混合して、スクロースクッション(スクロースの不連続勾配)を調製します。
特定の量のスクロースクッション溶液を培地含有チューブに加えます。溶液は底部に別の層を形成します。次に、チューブを高速で遠心分離します。スクロースクッションは、エクソソームの完全性を維持しながら、培地からスクロース溶液へのエクソソームの移動を促進します。高密度タンパク質汚染物質は、スクロース溶液と培地の間の界面を占めます。
エクソソーム含有スクロース層の大部分を、適切なバッファーを含む新しいチューブに慎重に移します。高速で遠心分離して、精製されたエクソソームのペレットを取得します。スクロース含有上清をタンパク質汚染物質とともに廃棄します。エクソソームペレットをバッファーに再浮遊し、さらに使用するまで低温で保存します。
収集したコンディショニング培地を事前にクリアするには、摂氏4度で500 x g で5分間遠心分離します。上清を新しいチューブに移し、ペレットを廃棄します。回収した上清でこの遠心分離ステップを繰り返した後、上清を再度回収し、ペレットを廃棄します。
次に、回収した上清を2,000×gで15分間、摂氏4度で遠心分離します。上清を保持し、ペレットを廃棄します。上清を20ミリリットルのシリンジに取り付けた0.22マイクロメートルのフィルターを通して、新鮮な遠心分離管に一度ろ過します。
一方、酸化重水素で25%スクロース溶液を調製するには、ユニバーサルチューブで1.9グラムのスクロースを正確に計量します。次に、重量が7.6グラムに達するまで酸化重水素を加えます。次に、超遠心分離管に22.5ミリリットルの事前にクリアされたコンディショニング培地を入れます。
ガラスピペットをチューブに入れます。ピペットを通して3ミリリットルのスクロース溶液を加え、溶液が調整された培地の下に別の層を形成するようにします。層状のコンディショニングされた培地のスクロース溶液を含むチューブをスイングアウトローターのバケツに慎重に入れます。
バケツをローターに固定します。ローターを超遠心分離機に入れ、摂氏4度で100,000 x gで1.5時間回転させます。先端を10マイクロリットルの先端に取り付けたP1000ピペットを使用して、チューブから2ミリリットルのスクロース層を一度に1ミリリットルずつ収集し、洗浄のために20ミリリットルのろ過されたPBSを含む超遠心分離機ボトルに加えます。
チューブを固定角ローターに入れ、摂氏4度で100,000 x g で1.5時間遠心分離します。10ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、上清を慎重に除去します。ペレットを400マイクロリットルのろ過PBSで再懸濁します。