使用年齢に依存するゲノム不安定性を研究して S.出芽酵母時系列寿命モデル

この手順の全体的な目的は、時間的寿命と一連の簡便なDNA損傷および変異アッセイを組み合わせることで、酵母における加齢依存的なゲノム不安定性を研究することです。これは、まず2日ごとに時間的加齢培養物をサンプリングし、コロニー形成単位（CFU）形成による生存率を確認することで達成されます。手順の次のステップでは、加齢培養物をサンプリングし、変異特異的な選択培地に細胞を播種してDNA変異を検査します。

最終的に、変異アッセイの結果を生存率で標準化することにより、酵母の時間的加齢におけるDNA変異の変化を示す結果を得ることができます。この手法は、加齢とゲノム不安定性を結びつけるメカニズムなど、加齢研究分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。酵母の時間的寿命（CLS）を測定するには、まず、単一の酵母コロニーを1 mLの合成完全グルコース培地（SDC培地）に接種し、30 °Cで振盪しながら一晩培養します。翌日、一晩培養した培養液を新鮮なSDC培地10 mLに希釈し、OD 600を0.05から0.1に調整した後、30 °Cで振盪しながら3日間培養します。

3日目に、細胞が定常期にあるとき、各Eloquaをオートクレーブ滅菌水で10,000倍に希釈し、次にフラスコから10 µLずつ2つの分注量を取り出し、希釈した各培養液10 µLをA-Y-E-P-Dプレートに塗布します。コロニーが出現するまで、プレートを30 °Cでインキュベートします。3日目の培養液から出現したコロニー数またはコロニー形成単位を、生存率100%と見なします。

以降の日々も、プレート播種のために老化培養液から分注を継続します。CFUアッセイにおいて約20〜100個のコロニーが得られるよう、希釈倍率を適宜調整してください。培養液の生存率が1%未満に低下した時点でサンプリングを終了します。これは通常11日目から13日目の間になります。また、プレート上で老化させた細胞を用いて生存率を検討することも可能です。

このアッセイを開始するには、単一のコロニーを1 mLの合成完全グルコース培地に接種し、30 °Cで振盪させながら一晩インキュベートします。培養液が約10⁸ cells/mLまで増殖したら、オートクレーブ滅菌水を用いて、10 µLあたり100～200 cellsおよび1000 cellsになるように培養液を希釈します。各株について、播種密度に従ってラベルを貼ったトリプトファン欠損SDCプレートを8～20枚用意します。

老化に伴う生存率の低下を想定し、10〜100個のコロニーを計数できるように、希釈した培養液を10〜30 µLずつ2回、各プレートに分注します。プレートセットを30 °Cでインキュベートします。寿命解析期間中、プレート播種当日およびその後2日ごとに1枚のプレートを取り出し、生存細胞を増殖させるため、トリプトファン0.5 mLを滴下します。その後、プレートを30 °Cでさらに48〜72時間インキュベートします。

48～72時間後、トリプトファン添加日の生存率をCFUで測定し、時間的老化におけるDNA損傷と突然変異頻度を分析します。酵母のCLSアッセイでは、野生型株と並行して、特殊な性質を持つ複数の変異株を培養します。

自然突然変異頻度は、経時的に老化させた培養液におけるカナバニン耐性の頻度を測定することで評価できます。形質膜アルギニンパーメアーゼをコードするCAN1遺伝子の変異により、細胞はアルギニンアナログであるL-カナバニンに対して耐性を持ちます。カナバニン耐性細胞は、L-カナバニン硫酸塩を添加したアルギニン欠損合成完全培地プレート上で増殖します。TRP1コーディング配列にアンバー変異を持つ株におけるtrp⁺復帰頻度の測定により、酵母の経時的な老化過程における塩基置換率を推定することが可能です。

陽性復帰細胞はトリプトファン欠損プレート上で増殖します。lyse陰性株EH1-50は、オープンリーディングフレームに+4シフトを有しており、その結果リシン欠損となりますが、これは小さな挿入または欠失変異によって復帰させることができます。粗大な染色体再編成（gcr）を検出するため、復帰変異体はリシン欠損プレート上で選別されます。

染色体5のcan1からテロメア側へ7.5 kbの位置にあるHX T 13がU3カセットによって破壊された変異株を使用します。can1およびU3の両遺伝子の変異により、細胞はそれぞれL-Canavanおよび5-フルオロオロト酸に対して耐性を持ちます。両方の遺伝子に点突然変異が起こる頻度は低いため、L-Canavanと5-フルオロオロト酸の両方への耐性頻度を解析することで、相同組換えおよび非相同組換えのレベルをモニターするためのgcrの推定が可能になります。時間的老化の過程で、100%相同な反転反復配列または91%相同な反転反復配列を持つ変異体が生成されます。

IRSのhis3遺伝子座における組換えにより、機能的なhis3タンパク質が発現します。したがって、組換えが起こった細胞は、ガラクトースを添加したヒスチジン欠損プレート上で増殖します。3日目、細胞が静止期に達した時点で、各老化培養液から適切な量の細胞を回収します。

すべての分析で同じ手順が用いられるため、ここでは1つのサンプルのみを処理します。このビデオでは、ベンチトップ遠心機で遠心分離して細胞をペレット化します。上清を除去し、1 mLのオートクレーブ済み水で細胞を再懸濁してください。

再び上清を除去し、細胞ペレットを100 µLの水で再懸濁させ、目的の復帰変異体を選別するために適切なプレートに細胞を播種します。プレートを30 °Cでインキュベートし、3〜4日後にCFUをカウントします。変異頻度は生存細胞数で標準化されます。このグラフは、野生型細胞の生存期間を、S CH nine delta TOR one deltaおよびRAs two delta変異体の生存期間と比較した、典型的な時間経過生存率アッセイの代表的な結果を示しています。

液体培養において、TOR1、SCH9、またはRAS2を欠損した変異体は、時間的寿命が延長します。さらに、SCH9とRAS2の両方の欠損は、さまざまな炭素源の存在下で時間的生存における寿命促進に相加的な効果を示します。NC2生存率アッセイを用いた結果を次のグラフに示します。

1日目、SDC野生型培養物を希釈し、炭素源を含まないSC trip dropoutプレートに塗布した。グルコース、エタノール、またはグリセロールを添加したSC Trip dropoutプレートを30 °Cで2日ごとにインキュベートした。各セットから1枚のプレートを取り出し、成長およびコロニー形成を可能にするために適切な栄養素を添加した。

年齢依存的な変異頻度は、菌株、背景、遺伝子操作、培養条件、および年齢によって大きく異なります。この表は、野生型菌株で得られた典型的な結果を示しています。損傷乗り越え合成（trans lesion synthesis）の代表的な結果は、次の画像に示されています。

加齢に伴う変異頻度の増加には、核抽出物とさまざまなDNAテンプレートを用いた誤ったDNA修復の変化が関与している可能性があります。私たちは、時間経過により老化させた細胞における翻訳合成（TLS）を評価することができます。定常期にある3日目の野生型およびSCH9欠損変異体細胞からの核抽出物を解析しました。

損傷のない鋳型を持つTLS産物は実線で、損傷のある鋳型を持つTLS産物は点線で示されています。長寿のs CH nine delta変異体の核抽出物では、損傷乗り越え合成は観察されませんでした。フリープライマーは白抜き矢印で示されています。このビデオを視聴することで、酵母における経時的寿命およびDNA変異分析の実施方法について十分に理解できるはずです。