マウスの永久中大脳動脈結紮の応用

本手順の全体的な目的は、動物モデルを用いて局所的脳虚血を研究することです。まず、左眼と耳の付け根の間の皮膚に小さな切開を加えます。次に、頬骨弓と鱗状骨の接合部で開頭術を行い、中大脳動脈を露出させ、小型血管焼灼器を用いて中大脳動脈を結紮します。

最後に、皮膚を縫合して傷口を閉じます。最終的に、マウス脳の左半球に梗塞部位が認められる結果が得られます。脳はTTCで染色するか、あるいはMRIでスキャンすることで、脳梗塞を可視化することができます。

脳卒中の脳組織は、タンパク質またはmRNAの発現解析にも利用できます。こんにちは、私はロチェスター大学のGale Johnson研究室で大学院生をしているGarza Cholaです。

この手法は、虚血性脳における細胞死に至るメカニズムを解明するなど、脳卒中分野における重要な疑問への回答に役立ちます。手術の準備として、すべての手術器具、ガーゼスポンジ、および認知適用剤をオートクレーブで滅菌します。手術中は手術器具を70% ethanolに浸し、使用直前に滅菌ガーゼの上で自然乾燥させます。

手術の2時間前に、作業エリアに70% ethanolをスプレーします。マウスにbuprenorphineを0.05 mg/kg投与します。薬剤は手術直後にも再度投与し、その後、術後24時間は3〜5時間ごとに投与します。

麻酔蒸発器を用い、3%イソフルランと20%酸素の混合ガスでマウスを麻酔します。流量計で酸素量を調節してください。足指または尾をピンチすることで麻酔深度を確認します。

2%イソフルランを用いて麻酔レベルを維持します。マウスの眼に人工涙液を点眼し、手術操作中に眼を傷つけないよう注意してください。

アニマルクリッパーを使用し、マウスを右側を下にした側臥位に置きます。左眼と左耳の付け根の間の左側の領域を剃毛します。綿棒を使用して、ベタディン溶液と70% ethanolを交互に塗布し、患部を軽くこすって洗浄します。

繰り返し行う必要があります。直腸プローブに接続されたヒートパッドの上にマウスを置きます。体温を 37 °C に維持するため、ミネラルオイルを使用して直腸プローブを挿入します。顕微鏡下でマウスを右側臥位にし、テープで固定します。

ガーゼスポンジに窓状の切り込みを入れ、細い直線剪刀を用いて手術部位を覆います。左眼と左耳基部の間に垂直な切開を加えます。手術中に組織の過度な乾燥が生じた場合は、曲型止血鉗子を使用して手術野を確保してください。

綿棒を用いて滅菌PBSを塗布します。スプリングシザーズで側頭筋に水平方向の切開を加え、ピンセットでゆっくりと牽引して側頭筋を頭蓋骨からわずかに剥離させます。湾曲ピンセットで下顎骨を保持し、18ゲージの針を用いて、頬骨弓と鱗状骨の接合部で小さな側頭下開頭術を行います。

ボーンラン（骨用鉗子）を用いて頭蓋骨を少量ずつ除去し、MCAを露出させます。この際、頬骨弓および眼窩内容物を損傷させないように注意してください。小型血管焼灼器を用いてMCAの遠位部を結紮し、側頭筋を元の位置に戻して、5-0ナイロン縫合糸で縫合します。

切開部位を閉鎖するため、麻酔を中止し、直腸プローブを除去します。ブプレノルフィンを2回目の用量でマウスに皮下注射します。マウスを37 °Cに保持しておいたケージに戻します。

ヒーティングパネルを使用してください。その後24時間は、食欲や飲水量の減少、背中の丸まり、呼吸数の増加、被毛の逆立ちなど、マウスに不快な症状がないか注意深く観察してください。手術直後にリカバリージェルをマウスに与えてください。

手術後2～3時間待機します。その後、24時間まで3～5時間ごとにブプレノルフィンをマウスに皮下注射します。手術の24時間後、マウスを深く麻酔し、4%TTCで灌流します。

脳を取り出し、4%パラホルムアルデヒド溶液に一晩浸します。翌日、脳を切片作成用ブロックに固定します。カミソリ刃を用いて、脳を1 mm厚の切片にスライスします。

スライスをミリメートルスケールの定規の横に配置します。解剖顕微鏡に接続したデジタルカメラを使用し、ImageJソフトウェアを用いてスライスを撮影します。

ファイルメニューをクリックし、目的の写真を開きます。プログラム内の直線タブをクリックします。定規上の2つの目盛りの間に直線を描画します。

「Analyze」メニューをクリックし、「Set Scale」を選択します。既知の距離（Known Distance）を1に、長さの単位（Unit of Length）をmillimeterに設定します。「Freehand Circle」タブをクリックしてください。

円を描いて対側半球を囲みます。「分析」メニューをクリックし、「計測」を選択します。計算ウィンドウが表示され、描いた円の面積が示されます。

白線で囲まれた領域を除き、同側半球を囲むように別の円を描きます。前述と同様の手順で面積を測定してください。新しい値が計算ウィンドウに追加されます。

1回目と2回目の値の差が梗塞領域を表します。スライス厚1 mmで上記の手順を繰り返し、各スライスにおける脳梗塞面積を算出します。各スライスで算出した脳梗塞面積を合計し、脳梗塞体積を算出します。

この図は、野生型C57BL/6マウスにおいて中大脳動脈（MCA）を永久結紮した24時間後のTTC染色脳を示しています。脳梗塞部位は白色に現れ、異なる倍率および角度から観察できます。ここでは、梗塞部位の前方から後方にかけて、TTC染色した脳梗塞脳の厚さ1 mmの切片を示しています。

体積は手術から24時間後に算出しました。梗塞体積は約23 cubic millimetersです。この手法は、適切に行えば30分で完了させることができます。

ご視聴ありがとうございました。