Three-Chambered Array-Based Impedance Assay:電気インピーダンスを測定することにより、がん細胞の浸潤性を評価するリアルタイム解析技術

がん関連間質細胞は、組織基底膜に存在する転移性腫瘍細胞を引き起こす可能性のある化学的因子を分泌します。その結果、がん細胞は基底膜に侵入し、組織の細胞外空間に向かって移動します。

vitroでがん細胞の浸潤能力を測定するには、複数の3チャンバーアレイを備えたマルチウェルプレートから始めます。各アレイでは、下部チャンバーには間質細胞の接着培養があります。溶融インピーダンス測定微小電極(細胞の電気的活性を測定する小型電極)を備えた上部チャンバーは、癌細胞によって重ねられ、癌細胞は電極の上に存在する細胞外マトリックスでコーティングされた微多孔質膜に付着します。

インピーダンスベースの分析装置でのインキュベーション中に、間質細胞は走化性因子を培地に放出し、それが癌細胞に向かって移動します。これらの要因は、中央チャンバーの底側に存在する半透膜を通って移動します。

質細胞分泌因子は、接着したがん細胞に浸潤性表現型に変化するよう信号を送ります。応答して、浸潤細胞は微多孔質膜を通って移動し、膜の反対側にある断指電極に到達します。

時間が経つにつれて、より多くのがん細胞が電極に付着すると、細胞による電流の流れを妨げる細胞インピーダンスを引き起こします。細胞インピーダンスの測定は、がん細胞の浸潤の可能性を示しています。

3つの滅菌チャンバーすべてを組織培養フードに入れます。下部チャンバーの短辺にあるノブの位置を確認し、ノブが実験者を向くように下部チャンバーの向きを合わせます。

気泡を形成せずに、90マイクロリットルの培地に30,000〜50,000個の細胞を下部チャンバーから各ウェルに加えます。細胞運動性のポジティブコントロールとして、2つの下部チャンバーで5%のウシ胎児血清添加培地を使用し、ネガティブコントロールとして0%血清添加培地を使用します。

フード内で90〜10分間沈殿させた後、下部チャンバーを15度回転させます。次に、中央のチャンバーを上に置き、下部チャンバーのノブが中央チャンバーのノッチにスライドするようにします。アセンブリの長辺のそれぞれからカチッという音がするまで、チャンバーを垂直に下に押します。

160マイクロリットルの無血清培地をミドルチャンバーのすべてのウェルに加えます。ウェルが満たされた後、ドーム型のメニスカスが見えることを確認し、電極を下に向けて上部のチャンバーを中央のチャンバーに配置して、中央チャンバーと上部のチャンバーの青い点を揃えます。アセンブリの長辺のそれぞれからカチッという音が聞こえるまで、チャンバーを垂直に押し下げます。

20〜50マイクロリットルの無血清培地を上部チャンバーに加えます。組織培養インキュベーター内のデュアルパーパス細胞分析装置にアセンブリを取り付け、30分間待ってからバックグラウンドを測定します。

セルアナライザーソフトウェアを開き、使用するクレードルを選択し、[メッセージ]タブをクリックして、[接続OK]と表示されていることを確認して、アレイがクレードルに適切に配置され、電極がセンサーと適切に位置合わせされていることを確認します。

実験ノート」タブをクリックし、実験に関する可能な情報をすべて入力します。次に、「レイアウト」タブをクリックし、配列レイアウトの説明を入力します。次に、「スケジュール」タブをクリックし、「ステップ」メニューから2つのステップを追加します。1 回のスイープのバックグラウンド ステップと、100 回のスイープのテスト ステップ。

アレイをデュアルパーパスセルアナライザーインキュベーターに30分間入れたら、「再生」ボタンをクリックしてバックグラウンド測定を開始します。

バックグラウンド測定が完了したら、アレイをクレードルから取り外し、細胞培養フードに戻します。次に、100マイクロリットルの無血清培地に30,000〜50,000個の細胞を上部チャンバーの各ウェルに加えます。これらは、膜を正常に移動した後に電極が検出する細胞です。

アセンブリをフード内に30分間放置してから、インピーダンス測定のためにデュアルパーパスセルアナライザーに取り付けます。

アレイをデュアルパーパス セル アナライザーに戻し、[メッセージ] タブで [接続正常] メッセージを確認します。「再生」ボタンをクリックしてインピーダンス測定を開始し、「プロット」タブをクリックして信号の進行状況を監視します。

25時間前にエンドポイントに到達した場合は、[実行]ドロップダウンメニューから[中止]ステップをクリックします。データをエクスポートするには、グラフを右クリックし、リスト形式で「コピー」を選択し、スプレッドシートにデータを貼り付けます。